清洗液（酸液）的配方.docVIP

实验室操作 清洗液（酸液）的配方: 弱 次强 强 重铬酸盐（g） 100 120 63 浓硫酸（ml） 100 200 1000 蒸馏水（ml） 100 1000 200 较常用的为次强酸，新配制呈红色，经多次使用或遇有机溶剂呈绿色，表示清洁液已失效，需要配。 塑料及橡胶制品的处理： 先煮沸5min以上 用自来水清洗12遍以上 用双蒸水荡洗3遍以上 烘干 与玻璃器皿一起灭菌 96孔板清洗: 泡酸24-48hr（尽量没在酸液中） 捞出，用自来水冲洗12遍（注意冲洗每个孔） 双蒸水荡洗3遍 低温烘干（50摄氏度以下，且板要倒扣） 将板及盖照紫外3h 放置无菌室备用 另法:泡酸缸1h,自来水冲20遍,双蒸水冲10变,与pe手套\保鲜膜\皮筋一起照紫外一晚上,包装待用. 培养基配制: 成分（DMEM）：培养基干粉（1包/升），碳酸氢钠（据培养基袋口的说明加，经验值2g/l），青霉素（0.06g（10万u）/l），链霉素（0.1g（10万u）/l） 配成溶液后过滤除菌，用前加入10%血清 注意： 所用双蒸水需要新鲜烧的，因为放置过久的双蒸水PH值变化 先溶解碳酸氢钠，再溶解双抗，最后加入培养基干粉 过滤除菌的滤膜为0.22um，在滤膜上方可放置一张滤纸进行粗滤，使用前先灭菌处理 小牛血清在开封之前需经过灭活，156摄氏度水浴30min，由于血清本来就是无菌的，所以无需过虑除菌（所剩的血清都已经灭活了，后购买的需先灭活再用） 消化液配制： 成分：0.25g胰蛋白酶，0.02gEDTA，100mlPBS； 先把EDTA溶于100ml的PBS中，再加入胰蛋白酶，定容到100ml； 注意： 先加热溶解EDTA 再加入胰蛋白酶，混匀 0.22um滤膜过滤除菌 冻存液配制： 1．70%的基础培养基（不含血清），20%的血清，10%的DMSO 2．可以不加70%的培养液就加血清和10%DMSO，现配现用，加入细胞沉淀中 3．用枪轻轻混匀后分装于冻存管（2ml），一般最多只能加入1ml的细胞悬液，这样有利于复苏的存活率，然后逐步降温，步骤为： 1．4摄氏度放置30min 2．-20摄氏度放置1hr 3．-70摄氏度放置3hr以上（或过夜） 4．迅速转移至液氮中（放置在事先作好的纱布袋中，并做好标记，包括冻存细胞的名称、冻存时间和数量） 注：液氮罐须定期检查（每半个月或1个月检查1次），若液氮高度低于罐高的1/3，须及时补充液氮，并做好记录，以便下次估计充氮时间。 MTT溶液配制（四甲基偶氮唑盐） 浓度5mg/ml，将称好的MTT加入PBS溶液，震荡混匀溶解后用0.22um孔径的滤膜过滤除菌，4 摄氏度保存，由于MTT见光氧化，故在瓶外包纸避光保存。 PBS溶液配制: NaCl 8g KCl 0.2g Na2HPO4 1.15g(Na2HPO4.12H2O 2.9g) KH2PO4 0.2g 双蒸水定容到1L，调PH7.2-7.4 (杨艳丽: NaCl 8g KCl 0.2g Na2HPO4.12H2O 3.58g KH2PO4 0.24g 双蒸水 先抽滤 再灭菌) 洗瓶： 烘干（如果是干的可以免去烘干这一步） 泡酸24hr以上 酸缸中拿出清水冲洗，直至黄色退去 用刷子清洗器皿一遍，然后清水冲洗5-6遍（理论10遍以上） 单蒸水冲洗5-6遍 双蒸水冲洗5-6遍 烘干 玻璃器皿有盖的盖上（松弛便于蒸汽进入），用牛皮纸或报纸封住瓶口，放入高压灭菌锅内灭菌，无盖的玻璃器皿，用锡纸包住瓶口，再套牛皮纸，最后放入高压锅（121摄氏度，20min） 将器皿放入烘箱，烘干（如果来不及可以省略，最后烘一遍） 放入细胞培养室，归类。 清洗盖子：用清水冲洗瓶盖，干净后放入沸水中煮沸10min，晾干（不要放入烘箱中或高压锅内） 细胞复苏: (细胞房用之前要去紫外灯照射30min) 先从液氮罐内迅速拿出需要复苏的细胞，迅速放入37摄氏度的水浴中，并不停的摇晃，注意瓶口不要碰到水面，以防污染细胞； 将盛入37摄氏度水浴中的细胞连同烧杯一起带入细胞房，待细胞均匀融化后，拿出； 将细胞悬液倒入离心管，加入3-4滴完全培养基，放入离心机中离心1500转（调两档），3-4min，观察细胞沉淀情况，如果太少，再次离心3-4min； 将离心管拿出，倒掉上清液，在离心管中加入2滴培养液，并用弯头滴管伸入液面以下不断吹打（注意不要将弯头伸出液面，以防有气泡产生，影响细胞生长）； 将新的细胞培养瓶中加入两滴管培养液，再将离心管中的细胞转入新的细胞培养瓶（以防加入时产生气泡）并使细胞散步均匀； 用酒精擦拭瓶身，显微镜观察细胞形态（有透明的圆的细胞漂浮其中），培养瓶上写明日期及培养细胞的名称； 将培养瓶的盖子稍松，放入CO2培养（便于CO2进入）待第二天观察（细胞一般4小时贴壁）；