普通生物学第四篇遗传与变异第23和24章幻灯片.pptVIP

第4篇 遗传与变异;23.1 基因工程的相关技术 23.2 基因工程主要的工具酶 23.3 基因克隆的质粒载体 23.4 重组DNA的基本步骤 23.5 基因工程的应用;重组DNA技术;23.1 基因工程的相关技术;;分子探针;放射性标记物 常用的同位素有32P、3H、35S 非放射性标记物 应用较多的是生物素和地高辛。二者对亲和素有独特的亲和力，通过连接在亲和素上的显色物质(如酶、荧光素等)进行检测。 ;核酸印迹;Southern印迹;10;11;Northern印迹: Northern blot, 是用来分析RNA的。Northern印迹的方法与Southern印迹基本相同，可参照进行。 斑点印迹：Dot-blot，将待测核酸样品变性后直接点样在膜上，称之为斑点印迹。但不能鉴定所测基因的分子量。 原位杂交：将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。用来检测完整细胞中的核酸序列。 ;聚合酶链式反应（PCR）;PCR的基本步骤： 变性、退火、延伸三???反应：;Target Sequence;Target Sequence;Target Sequence;Target Sequence;19;No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824;23.2 基因工程主要的工具酶;限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别并切开核酸序列特定的位点——分子手术刀。 Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。 已经发现和鉴定了200多种。 限制性内切酶识别DNA序列中的回文序列。有些酶的切割位点在回文的一侧，因而可形成粘性末端，另一些酶切割位点在回文序列中间，形成平头末端。 ;粘性末端 ;DNA连接酶;切口nick; DNA连接酶有两种：;T4 连接酶; 平齐末端DNA片段的连接：;29;30;反转录酶又称RNA指导的DNA聚合酶。是以RNA为模板合成DNA的酶。 这种酶是1970年美国科学家特明（H.M.Temin）和巴尔的摩（D.Baltimore）分别于动物致癌RNA病毒中发现的，他们并因此获得1975年度诺贝尔生理学或医学奖。 主要用途是从mRNA反转录合成互补DNA（cDNA）。 ;23.3 基因克隆的质粒载体;质粒：是细菌细胞中独立于染色体外可以自主复制的一段环状DNA分子。进入到宿主细胞中的一个质粒可以大量增加其拷贝数。;载体：是一种可以将外源DNA片段送入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具，这种工具也是一个DNA分子。 克隆载体：在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并引入到宿主细胞中进行大量繁殖，使外源DNA片段得到大量扩增。 表达载体：就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），使外源DNA片段能够在宿主细胞中表达蛋白质。 目前最常用的载体包括细菌质粒、l噬菌体、cosmid质粒等。;质粒做为克隆载体的必备条件： 具有复制起点； 携带选择标记； 具有多种限制酶切位点； 具有较小分子量和较高拷贝数； 具有安全性。;质粒载体pBR322是研究得最多，使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载体之一。符号质粒载体pBR322中的“p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是实验编号。 ;优点一：相对分子质量较小。质粒载体pBR322的大小为4361bp, 优点二：它带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。 优点三：具有两种抗生素抗性基因，可供转化子的选择标记。 优点四：具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增以后，每个细胞中可累积1000-3000份拷贝，该特性为重组体DNA的制备提供了极大的方便。 ;Features of plasmid pBR322 ;Restriction map ;1．该质粒比较小，可以插入一段较长的DNA片段。 2．进入宿主细菌细胞后，pUC18在每个细胞中可复制形成大约500个拷贝。 3．在pUC18中有一小段人为设计和插入的具有多种限制性酶切位点的序列，即多克隆位点;23.4 重组DNA的基本步骤;重组DNA操作一般步骤：; 获得目的基因常用的方法： 直接从生物体中提取总DNA，构建基因文库(gene library)，从中调用目的基因； 以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段； 利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段；