家族性高胆固醇血症LDLR新突变体的构建及其功能研究-病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 10 子和全部18个外显子共21个片段，直接进行DNA测序鉴定突变。用Trizol法从正常 人肝细胞中提取总RNA并纯化，并以纯化RNA为模板，反转录PCR合成LDLRcDNA全长； 将LDLRcDNA全长与PTA2载体连接、转化大肠杆菌、筛选菌落、提取质粒酶切和测序 鉴定，将正确PTA2载体克隆质粒送交广州复能基因公司负责组装到真核表达载体 pReceiver-M29,构建成含LDLR全长和EGFP绿色荧光蛋白融合表达的载体。以野生型 表达载体为模板，用QuickChange XL system诱变试剂盒(Stratagene)构建6种突变 体（357delG, 675delA, C210R, T383I, A459V, S565X）并经测序证实。将野生型 及6种突变体质粒转染HEK-293细胞，同时设一空白对照（未转染任何基因），转染 48h后提取总蛋白，采用Western检测LDLR蛋白；另外，将野生型及构建的6种新突 变体质粒瞬时转染HEK-293细胞，48h后分别在4℃和37℃与稀释在培养基中的 DiI-LDL共孵育，流式细胞仪分别检测LDLR结合、内化LDL的能力。 [结果] 各FH患者均未检测出ApoB100Q3500R突变，LDLR突变分析发现6个新突变，包括3 个错义突变（C210R, T383I, A459V）、2个缺失突变（357delG，675delA）和一个 无义突变（S565X）。筛选得到正确LDLR及突变体表达载体，测序结果无碱基突变及 阅读框移码。Western检测显示，与野生型比较，C210R, T383I, A459V三种错义突 变蛋白条带无显著变化；S565X出现一条截短的蛋白条带；2个缺失突变（357delG， 675delA）出现一条更短的蛋白条带。与野生型比较，6个LDLR基因新突变体导致细 胞结合能力、内化能力均明显降低，分别约为野生型的13%-34%，13%-35%。 [结论] 1、成功构建 6 种 LDLR 新突变体。 2、6 个 LDLR 基因新突变均损伤 LDLR 功能，细胞结合能力明显降低（13%-34%）， 内化能力也明显降低（13%-35%），其中 LDLR 基因突变型 A459V 结合能力、内化 能力均为最高（分别为 34%，35%），LDLR 基因突变型 675delA 结合能力、内化 能力均为最低。 3、根据突变患者临床表型和突变体功能实验证实 6 种突变是导致血浆胆固醇增 高的致病性突变。 [关键词] 家族性高胆固醇血症； 低密度脂蛋白受体； 基因突变； DNA 测序； HEK-293 细胞 Construction and Functional study of novel LDLR Mutants in Familial Hypercholesterolemia Patients ABSTRACT Familial hypercholesterolaemia (FH) is an autosomal dominant disease characterized by elevated total and low-density lipoprotein (LDL) cholesterol levels in plasma, resulting in skin and tendon xanthomata, and premature cardiovascular disease. The primary defects in FH patients are mutations in the gene encoding the LDL receptor (LDLR).The mutations of LDLR gene account for about a half in FH patients diagnosed by clinical features and blood lipid tests. Over thirty FH familily were analysed and twenty mutations including sixteen point mutations，two deletion mutation and two splicing mutation were identified in our laboratory. However，it’s not clear about whether these mutations are pathogenic and theirs pathogenic mechanism . To make clear the cause resulting in hyperli