DNA重组技术的重要工具分析总复习.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * （2）利用PCR技术扩增目的基因 PCR是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称，是一中在生物体外模拟发生于细胞内的DNA快速扩增特定基因或DNA序列的复制过程的技术，是一种分子生物学技术。由美国科学家K.B.Mullis于1988年首创。 概念： ③PCR的原理： 利用DNA双链复制的原理，将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量呈指数方式增加。 ④条件： 要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。 引物 (primer) 　　引物，台湾称作引子，是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，存在于自然中生物的DNA复制（RNA引物）和聚合酶链式反应(PCR)中人工合成的引物（通常为DNA引物）。 A.目的基因DNA受热变性后解链为单链 凡是破坏DNA双链的氢键和疏水作用的因素，如加热（超过70oC）、极端的pH、有机溶剂、低盐浓度等，都能导致DNA配对的碱基间氢键断裂，使双螺旋的两条链完全分开成单链，这种双链分开的过程称变性。变性DNA在适当条件下（如果降低温度），两条彼此分开的链又可重新缔合成为双螺旋结构的过程称为复性。 变性的概念： ⑤PCR扩增的过程是： 目的基因DNA受热变性后解链为单链； 引物与单链相应互补序列结合； 然后在DNA聚合酶作用下进行延伸； 如此重复循环多次。 高温变性： 将待扩增得DNA样品及其反应体系（包括引物、耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离子等）在95℃高温加热1min，使双链DNA模板两条链之间的氢键打开，变成单链DNA，作为互补链聚合反应的模板。 Taq DNA 聚合酶： 　　由一种水生栖热菌yT1株分离提取出，是发现的耐热DNA聚合酶中活性最高的一种。 B.引物与单链相应互补序列结合： 低温退火： 将反应体系降温（约55℃）1min，使引物与2条单链DNA模板发生退火作用，并结合在靶DNA区段两端的互补序列的位置上。 C.然后在DNA聚合酶作用下进行延伸： 适温延伸：将反应体系温度上升到72℃保温一至数分钟。在耐高温的DNA聚合酶催化作用下，dNTPs分子便从引物的3′端加入并沿着模板DNA分子按5′→3′方向延伸，合成新的DNA互补链。 由于延伸后得到的产物同样可以和引物结合，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。 此外，如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。 二、基因表达载体的构建 基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。 目的： 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 基因表达载体的组成： 是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。 使转录在所需要的地方停止下来。终止子位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNA短片段。 为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素基因就可以作为这种基因。 三、将目的基因导入受体细胞 将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。 1、将目的基因导入植物细胞 （1）农杆菌转化法 农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。 自然转化的过程： 当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。 （2）基因枪法： （3）花粉管通道法： 2、将目的基因导入植物细胞 （1）方法： 显微注射法是转基因动物中采用最多，也是最为有效的一种将目的基因导入动物细胞的方法。 （2）操作程序： 首先将含有目的基因的表达载体提纯，并使DNA浓度保持在1~3g/mL； 然后，从雌性动物体内取出卵（卵可以在体内受精，也可以在体外受精），采用显微注射仪进行显微注射； 再将注射了目的