急性运动性轴索型神经病动物模型的建立-神经病学专业论文.docxVIP

中文摘要急性运动性轴索型神经病动物模型的建立 中文摘要 急性运动性轴索型神经病动物模型的建立 摘 要 目的：急性运动性轴索型神经病(acute motor axonal neuropathy,AMAN)是格林一巴利综合征(Guillain．Barre syndrome，GBS)的一种亚型，在我国华北地区发病率较 高。其临床特点是运动功能受损明显，而感觉功能大多 正常，一般病情重，多有呼吸肌受累，2448小时内迅 速四肢瘫，肌萎缩出现早，病残率高，预后差。病理改 变为前根和周围运动神经轴索变性，轻度脱髓鞘，病灶 中炎性细胞浸润少见。目前AMAN的病因及发病机制 尚未确切阐明。AMAN与急性炎性脱髓鞘性多发性神经 病 facute inflammatory demyelinating polyneuropathy,AIDP)不同，因为AIDP已具有公认的动 物模型，即实验性自身免疫性神经病(experimental autoimmune neuropathy,EAN)，可用牛P2蛋白免疫Lewis 大鼠诱发，其病理及临床所见与AIDP相似，且病残率 高可重复性强。而关于AMAN动物模型的研究有很多， 其中本实验室曾用空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni， ci)免疫鸡使部分鸡发生类似AMAN病人的瘫痪，这 个模型在国际上引起重视。但是上述模型发病率较低， 用于进一步研究的实用价值有限，这促使我们进一步研 究建立发病率高且可重复性强的AMAN动物模型的方 法。神经节苷脂是一族酸性糖脂，它们由脂质与碳水化 合物两大部分组成，是哺乳动物神经细胞膜的主要成分 中文摘要之一，在脑内GMl，GDIa,GDlb，GTlb这四种神经节苷 中文摘要 之一，在脑内GMl，GDIa,GDlb，GTlb这四种神经节苷 脂含量丰富，其中以GMl最多，神经系统外含量甚少。 大量文献报道10-42％的GBS病人血清中含有抗神经节 苷脂抗体，尤其是抗．GMl抗体。有作者用GMl抗体阳 性的多发性运动性神经病(multifocal motor neuropathy,MMN)患者血清注入鼠的坐骨神经，引发了 传导阻滞并发现在郎飞结处有免疫球蛋白沉积；另外也 有用GDlb免疫日本大耳白兔引发感觉性轴索型神经病 的报道。这使我们认识到神经节苷脂及其抗体在GBS 发病中可能起重要作用。因此本研究探讨应用神经节苷 脂免疫实验动物建立AMAN动物模型的方法。 材料与方法：选择曰本大耳白兔作为实验动物，应 用牛脑神经节苷脂(Bovine Brain Gangliosides。BBG)或 神经节苷脂GMl作为免疫原，与Keyhole Limpets Hemocyanin(KLH)，弗氏完全佐剂(Freund’S Complete Adjuvant，FCA)一起于背部皮下及腹腔内两个部位注 射以免疫动物，每3周1次，直至动物出现瘫痪或首次 免疫后6个月仍无任何临床症状。在动物出现肢体无力 后，根据其病情严重程度，予当天或发病后20天内将其 处死，原则是在动物自然死亡前取材。将符合上述条件 的实验动物经心脏取血处死，迅速取其左右坐骨神经， 左右臂丛神经及部分脊髓的前后根，经修整后置入4％ 多聚甲醛固定液中。固定24小时后，可取出经磷酸盐缓 冲液(PBS，PH7．4)冲洗，浸入0．5％锇酸中振荡染色 1．5小时后，再用PBS(PH7．4)冲洗，之后经33％，66％， 100％甘油系列脱水后可保存于100％甘油中以备分离神 中文摘要经单丝，观察神经变性情况。另外，在实验过程中，每 中文摘要 经单丝，观察神经变性情况。另外，在实验过程中，每 周经耳静脉取血1次，放入EDTA抗凝管，轻轻摇匀经 离心可得血浆，将其分装，置．25℃保存。本实验应用酶 联免疫吸附实验(ELISA)检测血浆中抗．GMl IgG抗体。 首先将抗原GMl包被于96孔酶标板上(GMl 250 ng／100 “l无水乙醇)，在室温下蒸发干燥，之后每孔加200 u 1 1％牛血清白蛋白．磷酸盐缓冲液(1％BSA．PBS，PH 7．4)， 室温孵育2小时，PBS洗板5次，加100 p l待测血浆(用 1％BSA．PBS以l：500稀释，并行两孔)，置4C过夜。 PBS洗板5次，空于后加HRP标记的羊抗兔IgG作为 二抗(以I％BSA．PBS l：2000稀释)，每孔100ul，室 温孵育2小时。PBS洗板5次，加底物(10ml基质液中 含4mg邻苯二胺和5 p l 30％H202)100u l作用30分钟 后终止反应。在492nm处用酶标仪(anthos labtec 2010) 测吸光度A值。并行两孔A值的均值为最后实测值。 1％BSA．PBS做空白对照。如果空白对照A值O．2