猪精液DNA提取与检测方法的优化设计.docVIP

公猪精液DNA提取与检测方法的优化设计作者简介： 作者简介：刘向东（1983-），男，华中农业大学动物科技学院博士研究生，师从赵书红教授，主要从事分子生物学，免疫遗传学与动物育种的科研工作。 ? 基金项目：国家自然科学基金广东联合基金(U 0631005)和863项目(2006AA10Z195)资助。 刘向东 向安静 程文科 彭中镇 赵书红?? ?? 通讯作者：赵书红教授，博士生导师，主要从事动物功能基因组学和动物育种的研究工作。 （农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，华中农业大学农业，武汉，430070） 摘 要：笔者对猪精液基因组DNA的提取方法进行了初步研究，旨在建立一种最优化的提取高质量的猪精液基因组DNA的方法，为做好猪分子育种和分子生物学科学研究提供必要的技术支持。经过对比实验，我们最终确定了最优处理，分述如下：使用自然分层后精液下层的精子沉淀代替原始精液来提取DNA能够取得更好的效果；在本研究采用的1.5ml提取体系中加入50～100ul的精子沉淀，利用PK终浓度至200ug/ml消化6～12h，随后采用氯仿抽提1次，其余步骤按文中通用步骤所述，就可以获得高质量的基因组DNA。同时本研究也确定了低浓度琼脂糖凝胶电泳定性检测DNA质量的最佳条件：琼脂糖凝胶浓度为0.8%，电压为80V/20cM，DNA上样量为2ug，电泳至少30min 关键词：猪 精液 DNA提取 DNA检测 优化 基因组DNA是动物遗传物质的载体，随着分子生物学和分子育种的发展，基因组DNA提取与保存成为动物科学实验和生产育种过程中越来越重要的内容之一。猪是我国重要的动物性蛋白来源。在实际育种生产和科学研究过程中，我们通常需要大量高质量的公猪基因组DNA来进行遗传鉴定和科学实验。通常情况下这些DNA是从动物的血液、肌肉以及肝脏等组织中获取的。对于公猪而言，公猪的精液是相对于其他组织更容易获得的，所以利用精液来提取公猪DNA是更有效的方法。但国内目前尚没有最优化的公猪精液基因组DNA提取方案的报道。 提取动物基因组DNA的方法种类繁多，目前主要分成两种，一是试剂盒法，二是经典的酚仿抽提法。试剂盒法的优点是简便、快捷，但缺点是价格昂贵，有的产品DNA产率较低。酚仿抽提法虽然操作略微繁琐，但总的来讲价格便宜，而且能够获得高质量的基因组DNA，所以目前应用十分广泛。在利用酚仿抽提法提取基因组DNA的过程中，每一个环节均可影响实验的结果，其中初始样品类型、初始样品量、PK剂量与消化时间和酚抽提次数是重要的影响因素。因此，笔者基于经典的酚仿抽提法对猪精液基因组DNA的提取方法进行了初步研究，旨在建立一种最优化的提取和检测高质量的猪精液基因组DNA的方法，为做好猪分子育种和分子生物学科学研究提供必要的技术支持。 1材料 1.1 试剂 生理盐水、蛋白酶K（20mg/ml）、氯仿/异戊醇（24:1）、酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）、3M NaAC、10×TE Buffer（pH8.0）、5×精子提取液 10ml，混合均匀，高压灭菌，室温保存。 1.2 仪器和耗材 仪器设备：滴管、小烧杯；10ul、200ul、1000ul微量移液器；高速冷冻离心机；PH检测仪等； 实验耗材：10ul、200ul、1000ul枪头（用于吸取上清的要剪掉枪头尖）；1.5ml×3/样、2ml×1/样；酒精棉球等。 2方法 2.1 不同因素对DNA提取效果的影响 为了使比较基础一致，除改变的步骤外，其余的步骤均使用本文2.3通用方法。 2.1.1 将精液静置，待其自然分层，上层为精清，下层为精子沉淀。分别从精清和精子沉淀中各取200ul提取DNA，每组3个重复，比较其提取效果。 2.1.2 初始样品量对 分3组，每组4个重复，别取50ul，100ul，200ul精子沉淀来提取DNA，比较其提取效果。 2.1.3 分3组，每组2个重复，加入精子提取液和PK后，分别取消化4h、12h、48h来提取DNA，比较其提取效果。 2.1. 分两组，每组3个重复，加入精子提取液后，分别加PK10ul和20ul来提取DNA，比较其提取效果。 2.1. 分两组，每组2个重复，酚抽提分别1次和2次来提取DNA，比较其提取效果。 2.2 不同因素对电泳检测效果的影响 分析影响DNA的定性检测的不同因素，所用的DNA全部来自同一管高质量基因组DNA。 2.2.1胶浓度对电泳的影响 分3组，每组2个重复，分别用0.8%、1.2%的琼脂糖胶检测。 2.2.2电压对电泳结果的影响 分3组，每组2个重复，分别用80V、120V电压检测。 2.2. 分3组，每组2个重复，分别上样2ug、4ug、6ug基因组DNA。 2.3 通用方法 2.3.1精液DNA提取[1,2] 吸取100ul精子沉淀；加入400ul dd