课件：免疫组织化学技术.pptVIP

透射免疫电镜常用标记物 铁蛋白（Ferritin）：是含铁23%的一种蛋白质，分子量460kD，直径10-12nm，其核心含大量铁原子，故电子密度较高，在透射电镜下可直接看到。它的蛋白质外壳可与抗原结合成铁蛋白标记抗体。 过氧化物酶：利用酶作为抗原抗体复合物的标记物，在经酶对底物作用生成有较高电子密度的产物。 胶体金：是表面带负电荷的疏水性颗粒，可与抗体相吸附而标记抗体。由于金颗粒具有很高的电子密度，电镜下清晰可辨。 注意事项 抗体稀释度：并非浓度愈高愈好，应选择最佳稀释度的抗体。在浓度梯度实验中，选取特异性染色最强，背景着色最低的浓度为恰。 抗体保存：反复冻融可引起效价降低，特异性抗体以分装，冷冻保存为宜；亦可1:10稀释分装保存。 抗原热修复：利用高温可对福尔马林固定的石蜡切片进行抗原修复。 封固剂：树脂 免疫组织化学的定量 显微分光光度术（microspectrophotometer, MSP）：以物质分子对光谱的选择性吸收为基础，在显微镜下对生物样品微细结构中的化学物质进行定量测量的精密仪器。 流式细胞术（flow cytometry, FCM）： 荧光染色的单细胞悬液，恒速通过激光束测量区，细胞受激光照射后发生散射光和荧光。通过检测散射光可知细胞的体积，通过检测荧光可知细胞DNA或RNA的含量；细胞分选。 激光扫描共聚焦显微术（laser scanning confocal microscopy, LSCM ） ：对活细胞进行荧光定量测定，细胞内游离Ca的测定，广泛应用于神经科学。 图像分析仪（image analysis system, LAS ） ：分为摄像机、中心处理机和输出装置三部分，可自动获取有关图像的形态定量、灰度信息和三维结构信息，将光学信号转换为电子信号后定量分析。 参考书目 1. 免疫组织化学 刘彦仿 人民卫生出版社 2. 神经免疫细胞化学 朱长庚 科学出版社 3. 神经解剖学方法 鞠躬 人民卫生出版社 4. 实用免疫组织化学技术与图谱 于颖彦等 上海科学出版社 5. 免疫荧光基础 阮幼冰 人民卫生出版社 6. Immunoenzyme Multiple Staining Methods C.M.Van der.loos Bios scientific publishers Thank you! THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 免疫组化实验程序 抗原提取 抗体制备 抗体标记 染色反应 呈色观察 结果评价 免疫组织化学与免疫细胞化学 亲和组织化学 一、抗原和抗体 1. Antigen： 种类：完全抗原和半抗原 性质：具有免疫原性和免疫反应性；其特异性由表面的抗原决定簇（antigenic determinant）决定 提取和纯化： 神经生物学中的抗原：酶，神经肽，膜性结构成分，神经递质，类固醇 第一节 免疫组织化学原理 免疫球蛋白（Ig） 免疫组化中多用IgG 免疫球蛋白的结构：与抗原有结合能力的为Fab段 2. Antibody Polyclonal antibody: Polyclonal antibodies are produced by different cells, and in consequence, are immunochemically dissimilar; they react with various epitopes on the antigen against which they are raised. Monoclonal antibody: Monoclonal antibodies are the product of an individual clone of plasma cells. Antibodies from a given clone are immunochemically identical and react with a specific epitope on the antigen against which they are raised. 3. 多克隆抗体和单克隆抗体 抗体制备 Polyclonal antibody制备 动物：家兔、山羊 佐剂：Freund 免疫方法：皮下、静脉或肌肉注射 效价检测：放射免疫分析、琼脂双向扩散法 免疫球蛋白的提纯：柱层析，亲和层析 第一抗体：具有特异性 第二抗体：不具有特异性 免疫动物 细胞融合 选择培养 克隆化 效价检测 扩大培养 Monoclonal antibody制备 抗体标记（Antibody labeled) 荧光素标记 酶标记抗体 胶体金标记 铁蛋白标记 若要显示组织中