激发型CD40单抗联合CTL对人源化SCID小鼠B细胞淋巴瘤免疫治疗的实验分析-免疫学专业论文.docxVIP

激发型CD40单抗联合CTL对人源化SCID小鼠B细胞淋巴瘸免疫治疗的实验研究 激发型CD40单抗联合CTL对人源化SCID小鼠B细胞淋巴瘸免疫治疗的实验研究 摘要 激发型CD40单抗联合CTL对人源化SCID小鼠B细胞 淋巴瘤免疫治疗的实验研究 摘要 CD40分子属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员，为I型跨膜糖蛋白。人 CD40分子于八十年代中期被发现，分子量约为48KD，其基因定位于20q11-20q13．2， eDNA长约1．5KD编码277个氨基酸(AA)，其中氨基末端193个AA构成胞外段。 22个AA构成跨膜段，66个AA构成胞浆段。CD40分子介导的信号在特异性免疫 应答中居于重要的上游位置。该分子广泛表达在免疫系统以及非免疫系统的许多类 型的细胞表面，包括B细胞，树突状细胞，上皮细胞以及一些肿瘤细胞如B细胞淋 巴瘤。B细胞淋巴瘤是起源于B淋巴细胞的恶性肿瘤，常全身广泛转移，表现为多 器官侵犯。随着肿瘤的放、化疗技术的发展，大约50％．60％的B细胞淋巴瘤病人获 得临床缓解。然而残余的恶性细胞导致的肿瘤复发常有发生。本室研制的激发型 CD40单克隆抗体5ell对B细胞淋巴瘤的生物学行为有多重影响，包括：生长抑制； 膜表面粘附分子表达变化；凋亡敏感性的提高等等。体外实验结果提示了5ell对B 细胞淋巴瘤具有潜在治疗价值。 SCID小鼠即重症联合免疫缺陷(Severe Combined Immune deficiency)dx鼠，1983 年由美国学者Bosma首先发现于C．B．17近交系的小鼠，是由于位于16号染色体的 单个隐性基因突变所致。SCID小鼠的所有T、B淋巴细胞功能测试均为阴性，对外 源性抗原无细胞免疫及体液免疫应答，体内缺乏携带前B细胞、B细胞和T细胞表 面标志的细胞。SCID小鼠由于T、B淋巴细胞的缺失，为人类淋巴系统在其体内的 重建提供了可能，即SCID小鼠的人源化。这种人、鼠嵌合体为在小鼠体内有效地研 究人类免疫系统的功能及其机制成为可能，同时也为肿瘤免疫学治疗的研究提供了 一个独特的动物模型。 本课题的研究目的是建立人源化SCID小鼠人B细胞淋巴瘤模型，在此基础上 探讨激发型抗人CD40单克隆抗体5cil联合CTL对B细胞淋巴瘤的免疫治疗作用。 激发型CD40单抗联合CTL对人源化SCID小鼠B细胞淋巴瘤免疫治疗的实验研究 激发型CD40单抗联合CTL对人源化SCID小鼠B细胞淋巴瘤免疫治疗的实验研究 摘要 1．人源化SCID小鼠模型的建立及其鉴定 SCID小鼠腹腔注射环磷酰胺(CTX)抑制骨髓造血，连续4天后，通过腹腔注 射移植人外周血单个核细胞(PBMC)。移植4周、8周、12周后分别收集外周血、 脾脏、肝脏。荧光显微镜下观察SCID小鼠外周血中人CD3+、CDl9+细胞；流式细 胞仪测定小鼠全血中人CD3+、CDl9+细胞百分率；免疫组织化学分析SCID小鼠肝 脏和脾脏中人CD3+、CDl9+细胞：ELISA检测SCID小鼠血清中人免疫球蛋白IgG 含量。结果显示：(1)SCID小鼠移植人外周血单个核细胞4周、8周、12周后在小鼠 外周血中通过荧光显微镜下可观察到人CD3+、CDl9+细胞，4周后流式细胞仪测得 小鼠外周血单个核细胞中人CDl9+、CD3+细胞百分率分别为10．6％、31．7％：(2)免 疫组织化学结果显示在小鼠脾脏中存在人CD3+、CDl9+细胞；(3)移植人外周血单个 核细胞4周、8周、12周后ELISA测得小鼠血清中人免疫球蛋白IgG的含量分别为 390p．g／ml、1100ptg／ml、1040I|tg／ml。 2．CD40激发型抗体5ell体外促进CTL对B细胞淋巴瘤细胞株fDnudi)杀伤作用的 研究 人B细胞淋巴瘤细胞株(Daudi)在含51．tg／ml 5cll的培养基中培养24小时后， AnnexinV／PI结合实验测定凋亡率，流式细胞术检测Fas(CD95)表达率；单核细胞来 源的树突状细胞(DCs)经凋亡Daudi细胞负载、5cll刺激成熟后与自体T细胞共育诱 导肿瘤特异性CTL，JAM法检测经5c11、CTL或5c11联合CTL作用后，Daudi细 胞DAN片段形成率。结果显示：5cl 1作用后Daudi凋亡率没有明显改变，但Fas(CD95) 的表达率显著上调：体外诱导的特异性CTL能有效杀伤Daudi细胞， 5c11联合应 用显著促进了CTL对靶细胞的细胞毒效应。 3．5ell联合CTL对B细胞淋巴瘤的免疫治疗作用 选用经人源化的SCID小鼠，通过后肢腹股沟皮下注射人B细胞淋巴瘤细胞株 (Daudi)，建立人源化SCID小鼠B细胞淋巴瘤模型。以接种后1周、3周的小鼠作为 低肿瘤负荷、高肿瘤负荷小鼠，分别经腹腔注射5c11、肿瘤特