生物微生物的纯培养和显微性技术.pptVIP

可见光的波长在3900～7600?，光学玻璃透镜分辨本领的极限值可达0.2微米；而电子束的波长约为可见光的十万分之一 。 常见显微镜的分辨率： 光学显微镜 200nm 扫描电子显微镜 ~1nm 透射电子显微镜 ~0.1nm 3、相差显微镜 光线透过透明标本，波长（颜色）和振幅（亮度）没有多大变化，用普通显微镜观察透明标本，其形态和内部结构难以分辨。细胞各部分折射率和厚度不同，当光线通过时，直射光和衍射光光程有差别，而人眼看不到，但是可通过相差显微镜看到。 相差显微镜（phase contrast microscope ）采用特殊光学装置：环状光阑和相差板，利用光的干涉，将光的相位差转变为人眼可见的振幅差（明暗），使能不染色而看到活细胞及细胞内的某些显微结构。 其发明人F.Zernike因此获1953年诺贝尔物理奖。 4、荧光显微镜 荧光显微技术原理：荧光素吸收uv放出波长较长的可见光，因此在uv照射下，发荧光的物体会在黑暗背景显现为光亮有色物体。在免疫学和分子生物学应用广泛。 现在可以用一种荧光染料来区分革兰氏阳性和阴性细菌。右图中所示为 荧光染色的铜绿假单胞杆菌（革兰氏染色阴性，绿色）和蜡样芽胞杆菌（革兰氏染色阳性，橙色）。 5、透射电子显微镜（简写TEM） 用波长短的电磁波取代可见光，使分辨率提高。 工作原理类似，因光源不同，有区别: 1）电子遇空气中分子会发生偏转使物象不清楚，因此镜筒高真空； 2)电子带电荷，电镜是用电磁圈使之聚焦 ； 3)电子像人眼看不到，用荧光屏显示或感光胶片记录。 6、扫描电子显微镜（SEM） 扫描电子显微镜 大肠杆菌扫描电镜图 工作原理与光学显微镜和透射电子显微镜不同，是电子束扫描，激发样品表面放出二次电子，电子产生多少与标本表面立体形貌有关。电子经探测器收集，经光电倍增管和放大器，产生样品立体图像于荧光屏上。 主要用于：样品表面结构 7、扫描隧道显微镜（STM） 80年代出现的，原理：利用量子力学中的隧道效应。 其横向分辨率：0.1～0.2nm，纵向分辨率：0.001nm 这种分辨率足以对单个原子观察。 用这种显微镜可直接观察蛋白质、DNA、RNA等分子的结构。 厨房抹布上的细菌和霉菌 棉纤维上的汗垢 扫描隧道显微镜下的DNA 二、显微镜和显微技术 样品好坏直接影响观察结果。 考虑因素：根据所用显微镜特点采用合适制样方法，尽可能使样品生理结构稳定，采用各种方法提高反差。 二、显微镜和显微技术 光学显微镜制样 活体观察 染色 压滴法 悬滴法 菌丝埋片法 活菌 死菌 美蓝染色 简单染色 鉴别染色 革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢染色 特点：避免染色对细胞结构的破坏，用于运动性、摄食特性、生长繁殖过程中形态变化等观察 。 压滴法：菌悬液滴载玻片，加盖玻片直接观察； 悬滴法：盖玻片滴一滴菌悬液，反转置于特制凹载玻片直接观察 ； 菌丝埋片法：无菌小玻璃纸铺平板表面，涂布孢子悬液，培养后，取下玻璃纸置于载玻片，观察 。 光学显微镜样品制备－－活体观察 二、显微镜和显微技术 活体观察难看到微生物的细致形态和结构，需染色观察。染色前需要对样品固定，目的：杀死细菌使菌体黏附在玻片上；还可增加对染料的亲和力。 常用方法：酒精火焰加热和化学固定（ 95%酒精、酒精和醚各半的混合物、丙酮、1—2%的饿酸等） 二、显微镜和显微技术 光学显微样品制备－－染色观察 革兰氏染色法 ·革兰氏染色法：1884年，由丹麦病理学家革兰创造并使用的一种能鉴别细菌的染色方法。 大肠杆菌革兰氏染色 枯草杆菌革兰氏染色 二、显微镜和显微技术 电镜制样 样品观察前要固定和干燥，一般要重金属盐染色或喷镀，提高反差，使电子图像清晰。 二、显微镜和显微技术 透射电镜制样 覆盖有支持网的载网（一般为铜网、不锈钢、金、银等） 负染技术：电子密度高、本身不显示结构、与样品几乎不反应的物质，如：磷钨酸钠进行染色。 重金属盐不被样品吸附沉积在四周，若样品具有表面结构，重金属盐就进入表面凹陷部分，通过散射电子能力差异把样品外形和表面结构衬托出来。 负染技术简便易行，病毒、细菌鞭毛、离体细胞器、蛋白质和核酸可用此方法观察。 二、显微镜和显微技术 投影技术： 真空蒸发设备将铂或铬等对电子散射能力强的金属原子，由样品斜上方喷镀，提高样品反差。可用于病毒、细菌鞭毛、离体细胞器、蛋白质和核酸等观察。 超薄切片技术： 微生物个体虽小，微弱电子束无法透过整体标本，需制成100纳米以下的超薄切片才能看清内部细微结构。基本操作过程：取样、固定、脱水、浸透与包埋、切片、捞片、染色、观察。 透射电镜制样 二、显微镜和显微技术 浸没油与玻璃的折射率相近 很多原来由于在透镜及载片