光敏生物素标记eDNA探针在肾综合征出血热.PDFVIP

维普资讯 第6卷第 3期 中 国 扁 毒 学 vo!．6 No． 1991年 9月 VIROLOGICA SINICA sept．1g9I 光敏生物素标记eDNA探针在肾综合征出血热 实验诊断中的初步应用 赵洪礼 汪美先 姜绍谆 刘竣彬 安家泽 吕海 刘军连 (第四军医大学微生物学教研室 西安 710032) 摄 薹 本文用光敏生物紊标记曲 R3eDNA 探针杂交检测了HFRS患者外周血淋巴细胞 血请和屎沉淀细胞中 HFRS病毒核酸。结果 42份淋巴细胞标本中30份为阳性 ，48份血 请标本中有24份 出现阳性杂交信号，8l份尿沉淀细胞标本中s3份为阳性 ，表 明将此光敏 生物素标记的 eDNA探针用于 HFRS实验诊断和致病机理的研究是可行的。 关■髑：光敏生响素 eDNA探针 核酸杂交 肾综合征出血热 自1978年南朝鲜学者李镐汪首次从黑线短鼠肺组织审检出朝鲜出血热相关抗原以 来[I]，各国学者相继建立了多种检测肾综合征出血 (HFRS)病毒血清学方法，如免疫 荧光法、ELISA，血凝爱血凝抑制实验等 。 这些方法促进 了对 HFRS的免疫学， 临床和流行病学的广泛研究。本文 在成功地把 光敏生物素标记到 R3eDNA探针的基 础上，将此探针用于 HFRS 的早期诊断，观将方法和结果报告如下。 材 料 与 方 法 一 ， 生薹t捆 光敏生物紊为军事医学科学院研制 ，四氯哇蓝 (NBT)，5-澳■一氯 5一吲睬磷 酸 (DCIP)为 Sigms产品。 =，RI重量曩收 eDNA的太量蠢取 R3重组质粒由中国强防医学科学院病毒研究所抗长寿 惠囊l1l，摄取方法基术同冷泉港分子克隆手册。 - 、， 兰、竞t生囊素誊记镰朴 参照文献tl进行，主要步骤为，分别取等量 eDNA 和光敏生物 素漏匀置于凉水中，用200W 汞灯照射 1s分钟 (上述攘作在培室进行 )．然后用仲丁薄洗涤两次， 去除辞离的光敏生物素。加 t／2体积 的7．5mol／L醋酸氨和 ±倍 体积的无术乙醇，一加℃放置 l 小时以上，15000r／m 离心 15分钟．沉淀标记的 eDNA 探钟，真空干燥，加 2oII1TE(pH9．5)溶 解，--20℃保存备用。此光敏生物素标记 的 eDNA 据针可检出 lOpg的靶核酸序列lVl。 四、 ‘库誊奉 的采●和魁疆 取临床诊断为HFRs患者静弥血2ml，肝薷抗凝 ，用Fi~oI1-泛影葡 本文于109一年1e日l1月收搿．1991年元胄P1日謦目 牛-理在诧阳军医后赫部军事医学研究所 11oo~1 维普资讯 第 3期 赵擞礼等，光敏生物鬟标记 DNA撵制在暂综台杠出血热实验诤断中的初步应用 215 歧淋 巴细胞分离液 离心，取淋巴细胞层，用 0．01mol／LpH7．4PBS洗涤 3次，将细胞悬浮于 TNE 液中，加 1眄的盐酸胍裂解液 反复冻融 3次，用酚氯仿抽提 3次，2倍 乙醇沉淀 ，得到 HFRS病毒 粗翩核酸。同时取少量淋巴细胞涂片 ，IFAT检测病毒抗原 ．另取 0．5ml患者血清加 l0眄SDS50p．1。 室温作用 l0分钟酚氯仿处理 同上。取患者新鲜屎液 10ml。1500r／m 离心 i0分钟，弃上清，加^ 400~1TNE 液溶解 沉淀细胞，再加 20嘶SDS40pl，室温作用 l0分钟，酚氯仿处理同上。同法