LAMP引物的设计.pdf

环介导等温扩增 （LAMP ）引物设计 LAMP 引物设计关键点 ：Tm 值 ，引物末端稳定性 ，GC 含量 ，二级结构 ， 引物间距 1.Tm 值 引物 Tm 值采用 Nearest-Neighbor Method 进行预测 ，该法所预测的值 可能是最为接近真实情况。通常情况下 ，Tm 值会受实验条件所影响 ，例如盐浓 度、寡核苷酸浓度等 ，因此需在实验条件下对 Tm 值进行预测。  寡核苷酸 0.1 μM ；  Na+ 50 mM ；  Mg2+ 4 mM ； 各个引物的最终 Tm 值需尽量满足以下条件：  F1c/ B1c = 64-66 °C ；  F2/ B2、F3、B3 = 59-61 °C ；  LoopF/ LoopB = 64-66 °C ； 2.引物末端稳定性 引物的末端是 DNA 复制的起点 ，因此需要一定的稳定性。（通常情况下， 引物需要一个稳定的 5’端和一个相对不稳定的 3’端，自由能绝对值越高，则 形成的 DNA 双链越稳定，即越容易退火。)  F2/B2 ，F3/B3 ，LoopF/LoopB 的 3’末端自由能 ≤ -4 kcal/mol ；  F1c/B1c 的 5’末端自由能 ≤ -4 kcal/mol ； 此处的末端自由能指末端 6 个碱基的自由能。 3.GC 含量 引物的 GC 含量尽量在 40-65%。50-60%的 GC 含量可能会有更好效果。 4.二级结构 需确保引物不会形成二级结构 ，例如二聚体 ，发卡结构。 5.引物间距  F2 的 5’末端到 B2 的 5’末端约为 120-160 bp ；  F2 的 5’末端到 F1c 的 5’末端约为 40-60 bp ；  F3 的 3’末端到 F2 的 5’末端约为 0-60 bp ； 1.上传序列 打 开 PrimerExplorer V4 网 站 ：http://primerexplorer.jp/elamp4.0. 0/index.html 上传所选的 DNA 特异序列 （序列长度需小于 2000 bp ），参数选择 Automatic Judgment ，然后点击 Primer Design。系统 自动对所上传的序列进 行分析 ：  GC% ≤ 45% ，则判定为 AT Rich ；  45% < GC% < 60% ，则判定为正常 ；  GC% ≥ 60 ，则判定为 GC Rich ； 不同情况对引物的要求不一。 2.生成引物 点击 Generate ，系统会根据序列 GC 含量生成引物 ，点击 Detail Settings 可显示当前用于生成引物的条件。 然后点击 Display 显示所生成的引物。 如果生成的引物数量过多 ，可对条件适当的缩小以减少引物数量：  将 GC%最适条件 50-60%进一步缩小 ；  F1c/B1c Tm 值高于其余引物 5 °C ，可进一步缩小至3 °C 或更少 ； 如果生成的引物数量过少 ，可对条件适当放宽以增加可选引物 ：  序列为 AT Rich ，增加引物长度或降低 Tm 值 ；  序列为 GC Rich ，降低引物长度或增加 Tm 值 ； 长度及温度每次最多改变 1 个单位 ，当可生成较多引物时，停止改变条件。 3.引物信息 挑选合适的引物序列 ，选择 Confirm 进行确认。  绿色对应 F3/B3 区域 ；  蓝色对应 F2/B2 区域 ；  黑色对应 F1c/B1c 区域 ； 4.选择引物 根据不同序列的自由能要求 ，排除不合适的序列 ，F2/B2 ，F3/B3 ，F1c/B1c 之间的 Tm 值尽量保持一致。挑选出最适引物后 ，然后点击 Primer Information 保存引物信息 ，用以设计Loop 引物。 5.Loop 引物设计 （可选 ） Loop 引物可结合 “环区域”，从而启动扩增，增加LAMP 的反应速度。 返回到程序的最初界面 ，上传上一步所保存的引物信息 ，点击 Primer Design。 在