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DNA序列测定技术 目前应用的两种快速序列测定技术是 Sanger 等（ 1977）提出的酶法及 Maxam和 Gilbert(1977) 提出的化学降解法。虽然其原理大相径庭，但这两种方 法都是同样生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都 有固定的起点，但却随机终止于特定的一种或者 DNA序列测定技术 序列测定的技术和策略 Sanger 双脱氧链 终止法 Maxam－Gilbert DNA 化学降解法 测序策略 目前应用的两种快速 序列测定技术是 Sanger 等（ 1977）提出的酶法及 Maxam和 Gilbert(1977) 提出 的化学降解法。虽然其原理大相径庭，但这两种方法都是同样生成互相独立的 若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终 止于特定的一种或者多种残基上。由于 DNA上的每一个碱基出现在可变终止端 的机会均等，因些上述每一组产物都是一些寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的 长度由某一种特定碱基在原 DNA全片段上的位置所决定。然后在可以区分长度 仅差一个核苷酸的不同 DNA分子的条件下，对各组寡核苷酸进行电泳分析，只 要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道这上，即可从凝胶的放 射自影片上直接读出 DNA上的核苷酸顺序。 一 Sanger 双脱氧链终止法 Sanger 法 DNA测序的试剂 引物 模板 DNA聚合酶 放射性标记的 dNTP dNTP类似物 现行的逻终止法人加减法序列测定技术（ Sacger 和 Coulson ，1975）发展而来 的。加减法首次引入了使用特异引物在 DNA聚合酶作用下进行延伸反应、碱基 特异性的链终止，以及采用聚丙烯酰胺凝胶区分长度差一个核苷酸的单链 DAN 等 3 种方法。尽管有了这些进展，但加减法仍然太不精确，也太不得法，因此 难以广为接受。直至引入双氧核苷三磷酸（ ddTBP）作为链终止剂（ Sanger 等， 1977 ），酶法 DNA序列测定技术才得到广泛应用。 2 ，3ddNTP 与普通 dNTP不同之处在同它们在脱氧核糖的 3 位置缺少一个羟基。它们可以在 DNA 聚合酶作用下通过其 5 三磷酸基团掺入到正在增长的 DNA链中，但由于没有 3 羟基，它们不能同后续的 dNTP形成磷酸二酯链，因此，正在增长的 DNA链不 可能继续延伸。这样，在 DNA合成反应混合物的 4 种普通 dNTP中加入少量的一 种 ddNTP后， 链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争，反应产物 是一系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起始 DNA合成的引物末端到出现过 早链终止的位置之间的距离。在 4 组独立的酶反应中分别采用 4 种不同的 ddNTP，结果将产生 4 组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的每一个 A、每一 个 G或每一个 T 的位置上。 Sanger 法 DNA测序的试剂 １．引物 酶促测序反应中利用一个与 模板链特定序列互补的合成寡核苷酸作为 DNA合成的引物。在许多情况下，可 将靶 DNA片段克隆于 M13噬菌体或噬菌粒载体，以取得单链