理解免疫组织化学染色技术.ppt

医 学 免 疫 学 第27章 免疫组织化学技术 第27章 免疫组织化学技术Immunohistochemistry  【教学目的与要求】 教学目的： 免疫组织化学染色技术是一项非常成熟的蛋白检测技术，广泛应用于临床检测，其所应用的抗原抗体反应，更是很多其他免疫实验的理论基石。因此通过本次授课，要让同学掌握该项实验原理，做到融会贯通。 教学要求： 掌握免疫组织化学染色技术的概念和原理； 熟悉免疫组织化学染色技术的步骤、方法及操作步骤。 了解免疫组化技术的重要用途及相关其他技术（拓展）。 本质：组织化学染色+原位示踪技术 发展历程：免疫荧光法---酶标抗体技术—酶抗酶复合物技术—胶体金标记技术以及亲和标记技术---出现原位杂交技术及PCR技术。 外源性抗原：微生物、花粉等 内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿瘤相关抗原等 同种异型抗原：人类白细胞抗原、血型抗原 异嗜性抗原：人与其他动物、植物等之间存在的共同抗原 （2）抗体（antibody） 机体受抗原刺激后由B淋巴细胞,特别是浆细胞分泌产生的一种能与相应抗原发生特异性反应的球蛋白，称为免疫球蛋白。 特性：能够与相关抗原特异性结合。 （3）酶促反应：II抗用酶标记（如辣根过氧化物酶等），与底物发生酶促反应。 总结： （1）+（2）+（3）==免疫组织化学的优点： 酶---免疫酶法 荧光染料---免疫荧光法 铁蛋白---免疫铁蛋白法 胶体金---免疫金银法 放射性同位素----放射免疫法 根据染色步骤 直接法：例-免疫荧光探针 间接法：是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。 例：两步法，三步法及多步法 优点：提高灵敏度，同时避免多次标记I抗 根据结合方式： 抗原-抗体结合：例如过氧化物酶-过氧化物酶复合物法 亲和连接法：ABC法 S-P法 免疫荧光法 1.原理：抗原抗体特异性结合 用荧光素标记I抗进行反应。 2.特点：荧光显微镜下观察 1.目前应用最为广泛 2.原理：抗原抗体反应，酶标记抗体，加底物显色 3.特色：准、清、久、兼容。 1.标记物：特殊的金属颗粒-胶体金 2.特性：特别适用于电镜的单标记或多标记。也适用于光镜研究。 四、免疫组化技术特点：（熟悉） 1.原位性 2.显色反应 3.形态、代谢和功能三结合 4.定性、定位和定量三位一体 5特异性强 6.敏感性高 原始位置的反应：细胞层面—膜、核、浆 细胞器层面 形态—显色反应 代谢、功能—抗原含量及位置 原理决定该特点 “免疫组织化学实际是组织中特定抗原的显示！” 用下图来说明以上基本原理： 免疫组化具体怎么做的呢？ 时间：标本离体后30min内取材，并用固定液固定； 目的：保持组织的形态和结构的完整；尽量保存组织中的抗原 方法：4%甲醛溶液 机理：使蛋白质发生交联而起固定作用 ,影响细胞膜通透性,抑制酶的消化作用，从而保护蛋白质免受破坏） 切片： 4um厚度（相当于单层细胞厚度），并粘附于载玻片。 烤片： 70℃ 2h，目的---充分贴附 目的：暴露抗原,提高通透性,增强特异性染色 方法：高压修复，柠檬酸钠盐缓冲液，PH=6.0 , 0.01M 另外其他方法：消化酶修复、微波修复、煮沸等等。 PBS洗涤 3次 目的：消除非特异性染色（存在内源性荧光、内源性酶，内源性生物素、抗体或标记物不纯、过量等）方法：正常山羊血清封闭液封闭，室温下，10min。倾去血清 适当比例稀释I抗，37℃孵育1h或4℃冰箱过夜。 PBS洗涤 2min*3次 11、滴加显色剂： 如DAB ，室温，5min左右。 注意：光镜下掌握染色时间； 流水冲洗 5min 苏木素复染（细胞核0.1%盐酸-乙醇溶液分化 结果判读要考虑以下几个方面 A、定位：细胞质（为主），细胞膜，细胞核，细胞间质 B、阳性细胞数 C、染色强度 光学显微镜下结果判断判读举例： ? EnVison?系统染色原理 ※ 免疫组织化学在临床诊疗中的应用（了解） 用于鉴别肿瘤的组织来源 细胞受体检测 病毒性抗原检测 癌基因、抑癌基因蛋白与生长因子检测 重新认识某些肿瘤的组织发生、发病机制 器官或组织特异性抗原标记物 前列腺标记物： PSA， PSAP，PSMA，P504s 甲状腺标记物：TG，CT，TTF-1 甲状旁腺：PTH 黑色素细胞标记物：MB45，S100，MelanA 肺