细胞生物学的合理研究方法.ppt

研究技术、研究工具 显微镜的出现——细胞学说的建立 电子显微镜技术——进入超微与分子形态水平 超离心技术 细胞成分、代谢过程的 同位素示踪技术 精确定性、定量分析 单克隆抗体、分子杂交——生物工程 显微镜观察范围 肉眼观察范围 发明： 1934~1935 荷兰物理学家Zernike 设计和发明相差显微镜，并获得诺贝尔奖。 微分干涉相差显微镜 （DIC） 用超速离心技术分离细胞组分 流式细胞术是对细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。在分析或分选过程中，包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。（flow cytometer）。 利用植物细胞具有的全能性。 单倍体细胞培养 原生质体培养 流式细胞术（flow cytometry）可定量地测定某一细 胞中的DNA、RNA 或某一特异的标记蛋白的含量，以 及细胞群体中上述成分含量不同的细胞的数量，它还可 将某一特异染色的细胞以数万计的细胞群体中分离出来，以及将DNA含量不同的中期染色体分离出来，甚至可用于细胞的分选 * The Origin of Hela Cells * 图片来源：/index_files/images/Biotechnology/chapter08/074_large.jpg * 图片来源：/Photo/UploadPhotos/201002/2010021511412523.jpg * Structural proteins exhibit dynamic changes during salivary gland autophagic cell death. Salivary glands of staged wild-type Canton S animals stained with antibodies against α-Tubulin (red) and α-Spectrin (green) (top panels), with rhodamine phalloidin to visualize filamentous Actin (red; middle panels), and with antibodies against nuclear Lamin DmO (red) and Croquemort (green) (lower panels). Nuclei are labeled with TOTO-3 (blue) in all images. * 图片来源：/news169466895.html * 基本原理是：在一定波长的激发光照射下，只有携带发光基团D 的供体分子可被激发出波长为D的荧光，而同一激发光不能激发携带发光基团A的受体分子发出波长为A 的荧光。 然而，当供体所发出的荧光光谱D与受体上的发光基团的吸收光谱A相互重叠，并且两个发光基团之间的距离小到一定程度时，就会发生不同程度的能量转移，即受体分子的发光基团吸收了供体所发出的荧光，结果受体分子放出了波长为A的荧光，这种现象称为FRET 现象。在体内，如果两个蛋白质分子的距离在10 nm 之内，就可能发生FRET 现象，由此认为这两个蛋白质存在着直接的相互作用。 * 选择蓝色荧光蛋白（CFP） 和黄色荧光蛋白（YFP）的基因分别与目的蛋白（或 称供体蛋白和受体蛋白）的基因融合表达。如果这 两个融合蛋白之间的距离大于10 nm 时，在一定波 长的激发光照射下，只有供体蛋白中的CFP 被激发， 放出蓝色荧光。如果这两个融合蛋白之间的距离在 5～10 nm 的范围内时，供体蛋白中CFP 发出的荧光可 以被受体蛋白中的YFP 所吸收，并激发YFP 发出黄 色荧光。此时可以通过测量CFP 的荧光强度的损失量 来判断这两个蛋白是否存在相互作用。两个蛋白距离 越近，CFP 所发出的荧光被YFP 接收的量就越多，检 测器所接收到的蓝色荧光就越弱，而黄色荧光就越强。 反之就不会出现FRET 现象。荧光共振能量转移的效 率在很大程度上，反映了细胞内两种蛋白相互作用的 可能性与作用的强弱。 * 图片来源：/~cmallery/255/255hist/gk18x19.AR10.gif * 显微放射自显影的基本实验步骤如下：首先用合适 的放射性前体分子标记机体或细胞，根据实验的需要， 按标记的持续时间分为持续标记和脉冲标记。标记后的 组织与细胞可按常规方法制片，在