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e玫瑰花环实验报告 　　E花环实验　　一.实验原理　　人外周血T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞(SRBC)受体，能够与SRBC结合形成花环样细胞团(即E花环)。已证实E受体是人类T细胞所特有的表面标志。当T细胞与SRBC混合后，SRBC便粘附于T细胞表面，呈现花环状。通过花环形成检查T细胞的方法，称为E花环形成试验。根据花环形成的多少，可测知T细胞的数目，从而间接了解机体细胞免疫功能状态，判断疾病的预后，考核药物疗效等。由于T细胞的异质性，其对SRBC的亲和力亦不同，因而T细胞可形成不同类型的E花环，其中在4℃放置1h以上，所形成的花环数代表T细胞总数，称为总花环(Et花环)，而淋巴细胞与SRBC混合后不经4℃作用立即反应形成的花环称为活性花环(Ea花环)。　　二.实验结果　　三.讨论①.有的细胞能形成玫瑰花环的原因：人T细胞膜上具有CD2分子，能够与SRBC上的LFA-3结合，从而形成以人T细胞为中心，SRBC环绕四周，形状如玫瑰花环的细胞集团，即E玫瑰花环。此外，NK细胞膜上也有CD2分子，也能形成玫瑰花环，但是NK细胞的量非常少，形成玫瑰花环的数量也少。②.有的细胞不能形成玫瑰花环的原因：a.人血液中含有单核巨噬细胞，其表面没有CD2分子，不能与SRBC表面的LFA-3结合，因此不能形成玫瑰花环。b.实验中所用血液不够新鲜，也可能导致不能够形成玫瑰花环。c.时间不够长，导致T细胞表面的CD2分子不能够与SRBC上的LFA-3充分结合，因此只有一部分SRBC与人T细胞结合，其余SRBC没能够与人T细胞结合形成玫瑰花环。　　与淋巴细胞混合后离心速度不能过高，在Et花环试验中，置4℃应至少1h以上或过夜。　　3.绵羊红细胞以保存1周内最好，超过2周则与淋巴细胞结合力下降，超过5～6周则不能再用。实验室的绵羊红细胞保存的时间太长，导致其与淋巴细胞的结合能力下降，所以有的细胞可以形成E花环，而有的细胞不可以形成E花环。　　花环试验SRBC与淋巴细胞混合比例以100∶1～200∶1为宜，Ea花环试验中以10∶1～20∶1为宜；淋巴细胞离体后不能超过6h，否则会影响花环形成率。　　5.温度对实验结果影响较大，故实验温度条件应保持一致，从4℃取出后应立即计数。　　6.计数前将沉淀细胞重悬时，使细胞团块松散均匀即可，不可强力吹打，以免SRBC从淋巴细胞上脱落。　　心脏采集健康鸡抗凝血，制备%的RBC悬液，在96孔血凝板中，用PBS液倍比稀释纯化猪抗鸡RBCIgG，50μl/孔，每孔加入50μl%的RBC悬液，充分振荡混匀，室温静置1h，观察红细胞凝集结果，判断HA效价。　　猪抗鸡红细胞IgG抗体效价的测定　　用新鲜配制的%鸡RBC悬液，检测猪抗鸡红细胞IgG效价。红细胞凝集试验结果显示纯化猪抗鸡红细胞IgGHA效价为1:32。　　鸡RBC的致敏　　在%的新鲜鸡RBC悬液中加入半数凝集量的纯化猪抗鸡红细胞IgG，充分混匀后，4℃孵育2h；1000rpm离心5min，弃上清，用PBS液洗涤3次，去除未结合IgG；以无血清的DMEM/0培养基重悬，制备％lgG-RBC免疫复合物悬液。　　鸡RBC的致敏　　在%的新鲜鸡RBC悬液中加入半数凝集量的纯化猪抗鸡红细胞IgG，充分混匀后，4℃孵育2h；1000rpm离心5min，弃上清，用PBS液洗涤3次，去除未结合IgG；以无血清的DMEM/0培养基重悬，制备％lgG-RBC免疫复合物悬液。　　玫瑰花环试验　　在24孔培养板中培养稳定表达猪FcγⅡB各剪接异构体细胞株，同时设空载体转染、未转染正常COS-7细胞对照。待细胞长至单层50%～60％做玫瑰花环试验。　　取出细胞培养板，以37℃预温的无血清的DMEM/0培养基轻柔漂洗细胞，加入　　DMEM/0培养基500μl/孔，37℃孵育2h。　　吸弃培养液，每孔加入200μl0．5％猪IgG-RBC悬液，动作轻缓；37℃孵育l0min，　　室温静置35min。　　用PBS液轻柔漂洗6次；用甲醇室温固定细胞10min；PBS液漂洗3　　次；加PBS液500ul/孔，在显微镜下观察玫瑰花环形成。　　在细胞单层加入10μl/mlHRP标记兔抗猪1gG抗体，200μl/孔，37℃孵育30min。　　PBST充分洗涤，以AEC染色试剂盒进行染色；在倒置显微镜下观察鸡RBC的显　　色，待显色充分后，用PBST漂洗，中止显色。　　E玫瑰花环实验　　一每组所需实验用品　　1载玻片2盖玻片3消毒棉4擦镜纸5火柴6滤纸　　二每组所需用品：　　1甲醇：1滴瓶2染色液1：1滴瓶3染色液2：1滴瓶4PBS液：1洗瓶　　三所需药品的配制：　　1%柠檬酸钠配制50ml　　柠檬酸钠　　蒸馏水100ml　　或肝素