我国人用狂 犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析教学精品.pptVIP

我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析;狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）引起的人兽共患疾病，一旦发病，几乎100％死亡，疫苗接种是预防该病的重要措施。目前，我国人用狂犬病疫苗生产用毒株主要有aG、CTN-1V 和PV2061 株，其中aG 株和CTN-1V 株为我国自行分离并传代适应，PV2061 株来源于法国巴斯德株。上述病毒株生产的人用狂犬病疫苗经临床应用显示，具有良好的保护效果。; 我国人用狂犬病疫苗生产用原始种子4aGV、CTN-1V、PV2061 株病毒糖蛋白（Glycoprotein，G）全基因序列进行测定，分析3 株病毒糖蛋白氨基酸序列的同源性;1. 材料与方法;;1. 4 病毒G 区基因的扩增;1. 5 克隆测序 将PCR 纯化产物与pGEM-T vector 连接，转化 感受态大肠杆菌DH5α，蓝白斑筛选阳性克隆，经菌落PCR 鉴定后，送北京三博远志生物技术有限公司测序，每个片段至少送6 个阳性克隆。 1. 6 病毒糖蛋白生物信息学分析 应用DNAstar 中的MegAlign 软件分析3 株病 毒糖蛋白基因序列及氨基酸序列的同源性；应用 AntheProt 5. 0 及DNAstar 中的Protean 软件分析3株病毒糖蛋白的结构及潜在B 细胞抗原表位的差 异。 ;2. 结果;图1 4aGV、CTN-1V、PV2061 株病毒糖蛋白基因扩增产物电泳图;2. 2 4aGV、CTN-1V、PV2061 株病毒糖蛋白基因序列同源性分析;;2. 3 糖蛋白信号肽分析;;2. 4 糖蛋白跨膜区结构分析;图3 4aGV（A）、CTN-1V（B）和PV2061 株（C）糖蛋白潜在跨膜区域预测;2. 5 糖蛋白的二级结构预测 应用AntheProt5. 0 软件中的Gibrat 法对4aGV、CTN-1V 和PV2061 株病毒糖蛋白二级结构进行预测，结果显示，4aGV、CTN-1V 和PV2061 株糖蛋白氨基酸残基均富含潜在α 螺旋、β 折叠及卷曲结构，其比例分别为30％、31％、39％，28％、30％、41％和29％、30％、41％，3 株病毒糖蛋白发生扭曲、折叠的几率较高，易形成丰富的二级结构，见图4。;;2. 6 糖蛋白B 细胞抗原表位预测 结合4aGV、CTN-1V 和PV2061 株病毒糖蛋白 一级、二级及局部特殊结构，选取各株病毒糖蛋白亲 水性强，无α 螺旋、β 片层规则结构，并具有β 转角 的可塑性较大区域及表面可能性和抗原指数高的区 域，分别得到3 株病毒株糖蛋白潜在B 细胞抗原表 位区域，三者表位位置与数量相似，见图5 和表3。;;;信号肽结构常指新合成多肽链中用于指导蛋白 质跨膜转移（定位）的N-末端氨基酸序列，其至少含 有1 个带正电荷的氨基酸，中部有一高度疏水区以 通过细胞膜，并具有种属特异性。4aGV、CTN-1V、 PV2061 株病毒在N-末端前19 位氨基酸均存在潜 在信号肽结构，可引导病毒糖蛋白在细胞膜上表达。 此外，3 株病毒潜在信号肽结构氨基酸同源性仅为 78. 9％ ～ 94. 7％，这可能是在传代减毒过程中，病毒 对不同传代基质细胞的适应表征，反过来也间接影 响了3 株病毒在Vero 细胞中的适应程度。;Benmansour 等［11］通过对中和单克隆抗体逃逸株点突变的研究，对糖蛋白的中和抗原位点进行了初步定位，证明了糖蛋白含有3 个中和抗原位点，且均为空间依赖型抗原位点，但目前仍缺乏病毒糖蛋白线性表位的研究资料，因此本研究对4aGV、CTN-1V 和PV2061 株病毒糖蛋白二级结构进行了深入分析，结果显示，3株病毒糖蛋白均易发生扭曲、折叠，在多个区域存在α 螺旋、β 折叠及卷曲结构，形成丰富的二级结构，并在多个位点存在潜在B 细胞抗原位点。尽管目前尚无准确率较高的抗原位点预测方法，但本研究的分析结果仍可作为确定糖蛋白潜在优势表位的参考。此外，本研究应用特异性引物扩增不同株病毒糖蛋白全基因，并结合相应糖蛋白编码区序列的同源性分析，可初步实现病毒株的快速鉴定。;研究结果; 糖蛋白具有决定病毒毒力的关键位点，是狂犬病病毒中唯一能诱生宿主产生中和抗体的抗原成分，也能有效刺激T 淋巴细胞增生，并参与识别宿主细胞和膜融合，是狂犬病疫苗的重要组成蛋白，也是衡量狂犬病疫苗免疫保护性的重要指标。本研究对我国人用狂犬病疫苗生产株4aGV、CTN-1V、PV2061株病毒原始种子糖蛋白全基因序列进行了测定，并对3 株病毒糖蛋白的生物信息学进行了深入分析，为完善我国人用狂犬病疫苗生产用毒种的质控标准提供了支持。;谢谢