细菌单染色法及口腔微生物的观察.pptVIP

细菌单染色法及口腔微生物的观察 ━━基础生物学实验 一、实验目的 1 学习无菌操作，掌握 细菌的涂片和 单染色技术 . 2 了解口腔中的微生物及其观察方法 二、实验原理 (1)用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。染色可以分为单染（简单染色）和复染（革兰氏染色）。简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。 三、实验仪器、材料与试剂  生物显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、无菌芽莶，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、大肠杆菌Escherichia coli、金黄色葡萄球菌S. aureus的斜面菌种，吕氏美蓝染色液、石炭酸复红染色液、黑色素液或碳素墨水、香柏油、二甲苯、无菌水 四、方法与步骤 (一)观察枯草芽孢杆菌活菌常用压滴法制片(图 5-1) 1 将洁净无油腻的载片放 于自己右边前方，在中央放一小滴无菌水。 2 将酒精灯放于自己正前方，点燃。 3 用无菌操作方法从枯草芽孢杆菌斜面中沾取少量菌体，与载片上的水滴充分混匀，把接种环上残留的菌体杀来后，放回试管架。 4 用镊子夹一洁净的盖玻片，使其一边先接触菌液，然后将整个盖玻片慢慢放下，注意不要产生气泡。如菌液过多，可用吸水纸适当吸去一部分。 5 先用低倍镜然后转用高倍镜观察，观察时光线要适当调暗些。 (二)单染色法 1 涂片 在洁净无脂的载玻片中央滴片中央滴一小滴无菌水．用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约1-1.5cm2(图5-2A、B) 2 干燥 将涂片于室温中自然干燥。 3 固定 手执载片一端，使涂菌的一面向上，将载片通过微火2-3次。在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载片在火上烤，否则细菌形态毁坏(图5-2C)。 4 染色 将涂片置于水平位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约2min(图5-2D)。 5 水洗 倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处。直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止(图5-2E)。 6 干燥 自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦掉菌体(图5-2F)。 7 待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再用油镜观察。 (三)口腔微生物的观察 1．单染色法 (1) 在洁净无油腻的载片中央滴一小滴无菌水，用牙签挑取少许与水滴充分混匀，涂成薄膜。 (2) 将涂片于室温中自然干燥后，按上面单染色法的步骤，进行固定、染色、水洗，干燥后镜检。 2．负染色法 (1) 在洁净无油腻的载片的一端滴一小滴无菌水，用牙签取牙垢少许与水滴充分混匀，然后加少许黑色素溶液，充分混匀。 (2) 另取一载片将其边缘放在含菌载片的一端，然后推向另一端，则含菌载片上的混合菌被推成薄膜。 (3) 于室温中自然干燥。 (4) 镜检：将光线响亮，先用低倍镜观察，再用高倍镜观察。 五、注意事项 1无菌操作过程中，接种环灭菌后不能触及其他物品，挑菌不能过多。 2载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，菌膜宜薄。 六、思考与练习 1 无菌操作过程中，可否将棉塞放在桌面上？为什么？ 2 绘单染色后观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图。 3 绘你所观察到的口腔微生物的形态图，并注明使用的染色方法。 * 《基础生物学实验》精品课程 (2)无菌操作技术是促使微生物学迅速诞生的基本技术之一。通过无菌操作的初步学习，建立一定的无菌概念，有助于后续课程如动植物的组织培养、细胞培养、转基因技术的应用等实验的进行。 * 《基础生物学实验》精品课程