生物制品中影响支原体检验用培养基效能因素及支原体污染的清除方法.doc

生物制品中影响支原体检验用培养基效能因素及支原体污染的清除方法 ???????????????????? [摘? 要]本文以支原体检验用培养基为重点，系统介绍了支原体的特点及营养需求、支原体培养研究进展、影响培养基检测效能的因素以及支原体在兽用生物制品中污染的预防和清除办法。 ? ? 支原体是生物制品中较常见的污染物，即使有大量的支原体污染也不会像细菌、真菌那样在普通培养基上明显地观察到，必须有适宜其生长的培养基才行。因此，对于可检验出与否，培养基的质量是能否检验出支原体污染的关键[1]。 ? 1.支原体特点及营养要求 支原体（Mycoplasma）是目前所知的能在培养基中独立生活、自行繁殖的最小生物。它不同于其他原核生物的重要的特点是没有细胞壁，也不能合成胞壁前体，而是代之以三层结构的单位膜。支原体具有多型性、可变性、可过滤性、易溶解性、对干扰细胞壁合成的抗生素（如青霉素等）具有天然抗性等生物学特性[2]。 支原体基因组分子量小，生物合成能力有限，因此需要从体外摄取许多能通过细胞膜的大分子物质。此外，支原体内能量供应机构效率不高，必须从体外摄取大量能源物质，包括葡萄糖、精氨酸和尿素[2]。以下通过表格列出支原体培养基的一般组成成分及所需营养物质。 ????????????????????? ?????表1?? 支原体培养基的一般组成成分[3] 培养基组成 所含成分和功能 具体物质举例 使用说明 蛋白胨 提供胨、肽、氨基酸 乳清蛋白水解物、胰蛋白示、胰胨、示蛋白胨 ? 肉浸液 提供胨、肽、氨基酸、核酸前体、维生素、无机盐 Bacto牛心浸液肉汤、Bacto脑心浸液、pplo肉汤、支原体肉汤基础 ? 酵母浸液 提供核酸、核酸前体、维生素、氨基酸、生长因子 鲜酵母提取物、鲜酵母自溶物、酵母水解物 ? 血清 提供脂肪酸、胆固醇， 胆固醇为支原体属和尿原体属所必须，用于膜的合成 马血清、猪血清 马血清一般不用灭活，猪血清一般要加温灭活 能源 为支原体提供能量 葡萄糖、精氨酸、脲 ? 缓冲剂 减缓因酸碱度变化对支原体繁殖的影响 磷酸盐、HEPES ? 指示剂 为及时发现培养物中酸度变化，以避免支原体在不适宜酸度中死亡 酚红 一般含量为0.002% 抑菌剂 避免细菌污染 青霉素G、醋酸铊 青霉素G为1000000U/ml，醋酸铊为0.02g/ml 其他物质 满足个别支原体特殊需要 培养禽类的滑液支原体时要添加辅酶Ⅰ（NAD） 替代血清 卵黄可用来替换马血清，价格便宜，质量稳定[5-6] ? ? 2.支原体培养基研究进展 2.1辅酶Ⅰ（NAD）替代物? 培养禽类的滑液支原体、鸡败血支原体等时要添加辅酶Ⅰ（NAD），但其属于不耐热物质，配制较麻烦，使培养基质量不稳定。徐濂等(1986)[7]用烟酰胺替代辅酶Ⅰ，烟酰胺具有耐高压、价格便宜和使用方便的优点，即使在将马血清、葡萄糖用量减少一半的情况下，鸡败血支原体仍能生长良好。 2.2指示剂? 支原体培养基的常用指示剂为酚红，但其变色范围的pH较高（pH6.8-8.4），支原体生长后，培养基颜色变化较快，观察时间短且易出现假阳性结果。唐七义等(1992)[4]在培养莱氏支原体时加入溴甲酚紫作为指示剂（变色范围的pH较低，pH5.2~6.8）,使实验结果易于观察。 2.3缓冲剂? 一些发酵支原体能消耗大量己糖而产酸，因此培养基要有很好的缓冲作用。由于支原体对渗透压的要求，培养基中许可的缓冲剂总量是有限的，因此有必要寻找一些新的更好的缓冲剂，来代替磷酸盐缓冲剂。Pollack氏（1969）以及Switzer氏（1972）分别在肺炎支原体和猪肺炎支原体的培养基中加入N-三（羟甲基）-2-氨基乙烷磺酸或N-2-羟乙基哌嗪-N1-2乙烷磺酸，增强了培养基的缓冲能力。 2.4现国内外药典/规程采用的支原体检验法具体情况如下表 表2 欧洲、中国药典/规程中支原体检验法对比表 标准名称 培养基名称 pH值 质控菌株及灵敏度 培养条件、时间 检验对象 中国生物制品规程(2000) 猪胃消化液或牛心消化液的半流体及液体培养基 7.4±0.2 肺炎支原体（ATCC15331）（10-8)、口腔支原体（ATCC23714）(10-4) 35-37℃ 28天 细胞、病毒种子批、培养液、疫苗 中国兽 药典(2005) 改良Frey氏培养基、支原体培养基、无血清支原体培养基 7.7 滑液支原体、猪鼻支原体 37℃（平板需5%-10%CO2的潮湿环境）； 29天 禽源细胞和由禽胚组织或其细胞制成的活疫苗；其他种类细胞和病毒活疫苗；血清 欧洲（英国）兽药典(2005) 分离鸡败血支原体的培养基 7.8 鸡败血支原体ATCC19610 35-38℃（平板需5%-10%CO2的潮湿环境）；35天 主细胞库、生产细胞库病毒种子批以及对照