环境应答基因JWA对谷氨酸转运的影响-卫生毒理学专业论文.docxVIP

南京医科大学硕士学位i仑支缩略语 南京医科大学硕士学位i仑支 缩略语 AD Alzheimer’s disease 老年性痴呆综合症 alo antisease-JWA—oIigonucIco“de JWA反义寡核苷酸 API． acute promyelocytic leukemia 急性旱幼粒细胞性白血病 APS mnmonuim persulfates 过硫酸胺 AfrRA al】trans retinoic acid 全反式维甲酸 EAACl excitatory-amino acid carrier 1 兴奋性氨基酸载体1 EAAT3 excitatory amino acid transporter 3 兴奋性氨基酸转运体3(同EAAC 1) FITC fluorescence isothiocyanate 异硫氰酸荧光素 GTP guanosine triphosphate 乌苷三磷酸 GTRAP3-18 glutamate transporter EAACl·associated谷氨酸转运体相关蛋白 protein HBE Human bronchial epithelial 人支气管上皮细胞 PMA phorbol 12-myristate 13．acetate 佛坡酯 PKC protein kinase C 蛋白激酶C PIPES piperazine-N‘．N-bis—ethanesulfonic acid 哌嗪一N’，N’一双乙磺酸 PMSF phenylmethylsulfonyl fluoride 苯甲基磺酰氟(蛋白酶抑制荆) PRAl prenylated Rab acceptor 异戊二烯化Rab受体一l TBS ，rris-buffered saline Tris～缓冲盐溶液 TEMED N’，N’，N’，N’一tetramethylethylenediamine N’，N’，N’，N’～四甲基乙二胺 2 环境应答基因JWA对谷氨酸转运的影响南京医科大学公共卫生学院 环境应答基因JWA对谷氨酸转运的影响 南京医科大学公共卫生学院 南京210029 研究生 齐泓 指导教师 周建伟 指导小组 张正东李爱萍 摘要 人类疾病往往是环境因素与遗传因素共同作用的结果，探讨基因与环 境的相互作用机制与规律，对于防治环境因素造成的机体危害具有重要意 义。1998年，周建伟等利用差异显示高通量筛选技术从培养的原代人的气 管和支气管上皮细胞中分离克隆了一个在生物进化上高度保守的环境应答 基因—，删基因，其编码蛋白是一种新的微管相关蛋白，并受多种分化诱 导剂如维甲酸(RA)、13顺一维甲酸(13-cRA)、三氧化二砷(AS，O、)和 佛波酯(PMA)等调控，该基因可能参与多种白血病细胞的定向分化和凋 亡，并与细胞应答环境中的热应激和氧化应激的信号转导通路有关。国外 研究报道，与JWA基因同源的大鼠E18表达的蛋白GTRAP3—18可能是一 种与Na+4衣赖的谷氨酸转运体EAAT3具有相关作用的新蛋白，并且能调控 EAAT3介导的谷氨酸摄取。本研究旨在探讨JWA蛋白与谷氨酸转运的关系 及其可能的机制，并进一步研究JWA参与调节环境污染物农药氰戊菊酯对 细胞内氨基酸转运的影响。 为研究JWA基因对谷氨酸转运的影响，用pCMV2．flag-JWA载体转染 的HEK293细胞，建立JWA高表达模型；用反义寡核苷酸技术抑制细胞内 JWA表达，建立JWA低表达模型；用激光共聚焦显微镜检测细胞内Ca2+ 的含量，用免疫荧光和Western blot法检测细胞内JWA蛋白的分布和表达 水平。掺入『3HI—D，L一谷氨酸为标志物观察JWA基因对细胞摄取谷氨酸的影 水平。掺入『3HI—D，L一谷氨酸为标志物观察JWA基因对细胞摄取谷氨酸的影 响。根据JWA基因编码氨基酸的磷酸化位点的位置，分别构建了四个含不 同长短JWA编码区多肽片段的pEGFP表达载体，转染HEK293细胞后， 在活细胞观察佛波N日(PMA)对JWA表达和细胞内定位的影响。用不同浓度 结果表明：JWA基因高表达的细胞摄取谷氨酸增加，用反义寡核苷酸关闭 JWA后，谷氨酸摄取下降。PMA可增加细胞谷氨酸转运，转染JWA对PMA 引起的细胞谷氨酸摄取无显著影响。PMA还引起HEK293细胞内游离钙浓 度一边『生升高。PMA使转染pEGFP-JWA的HEK293细胞内JWA表达升高， 细胞内定位发生改变。用不同浓度的氰戊菊酯处理PCI2细胞后发现可诱 导JWA基因表达升高，并在一定浓度时促进细胞的谷氨酸摄取，提示该基 因可能在细胞应答环境污染物对神经递质的影响中发挥作用。JWA蛋白通 过非PKC途径增强HEK293细胞谷氨酸转运功能，增强谷氨酸介导的神经 兴奋传递，参