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同尾酶是指来源各异、识别序列不同，但产生相同的黏性末端的II限制性核酸内切酶。 如： BamHI (5’-G↓GATCC-3’ ) Bgl II (5’-A↓GATCT-3’) 3、II型限制性核酸内功酶不具有甲基化功能 如 EcoRI限制性核酸内切酶与 EcoRI甲基化酶，两者均识别GAATTC序列，而前者能对G↓AATTC序列进行切割，后者的作用是使第二个A甲基化。目前已经分离到许多II型限制性核酸内切酶与其对应的甲基化酶。 4、II型限制性核酸内切酶对单链DNA的切割 有一些II限制性核酸内切酶，除双链DNA外，还可以特异识别并切割单链DNA的相应位点，只是切割效率比较低。如Hha I能切割单链噬菌体ФX174和 M13mp18 DNA，只是切割单链 DNA比切割双链 DNA效率低50％。 五、Ⅱ限制性核酸内切酶的主要用途 ①产生具有相同粘性末端的DNA片段，以便重组克隆； ②建立DNA分子的限制酶图谱； ③构建基因文库； ④构建载体。 六、II型限制性核酸内切酶的酶切反应 1、标准酶解体系的建立 反应体积一般为20μl(根据DNA量可适当扩大)。 ① 10×酶切缓冲液 2μl(大部分酶反应缓冲液基本相似： 50mmol/LTris-HCl pH7.0~7.5、0~100mmol/L NaCl、 10mmol/L MgCl2、 1mmol/L DTT) ②酶(根据酶活力大小及工作性质确定酶量，不超过反应总体积10％ ③DNA样品(μ g~mg) ④无菌水 限制性核酸内切酶的一个活力单位(U)为：在合适的温度和缓冲液中，在 20 μ L反应体系中，1h完全降解 1ug 标准DNA所需要的酶量。 2、酶解反应 ①混匀 ②酶解(温度、时间) ③酶解鉴定 ④终止 a、加EDTA至10mmol/L； b、加SDS至0.1%(W/V)； c、65℃水浴保温20min(有些最适反应温度较高的酶不能使之完全失活，如 Ace III、BelI、BstXI、TaqI)； d、酚/氯仿抽提酶，乙醇沉淀DNA 3、限制性核酸内切酶对DNA的不完全酶解(见下图) 不完全酶解对于构建物理图谱和基因组文库是非常必要的。其方法有减少酶量、增加反应体积、缩短反应时间和降低反应温度等。 incomplete 1 2 3 1+3 incomplete digestion 1 2 3 Sma I complete 1+2+3 4、Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项 ①商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次操作时应使用新的吸头去取酶； ②加入酶的体积应不超过总体积的10%，否则酶液中的甘油浓度超过5%时将会抑制酶的活性； ③整个操作应在0℃进行，即在冰浴中进行，而且是在加入其它试剂之后，最后加入酶； ④尽可能使反应体积减到最小，即尽可能少加水； ⑤当切割大量DNA时，通常采用延长反应时间，减少酶的用量； ⑥当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液。若没有通用缓冲液时，只有用1种酶切完后，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。 七、影响限制性核酸内切酶活性与酶切效果的因素 1、酶的纯度； 要求不存在其他核酸内切酶或外切酶的污染。 2、DNA样品的纯度； DNA样品中的蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高NaCl等，都能抑制酶活性。 样品中DNase会降解DNA，影响酶切。 3、酶切反应的温度、时间； 多数II型限制酶最适反应温度是37℃，但SmaI为25℃或30℃，SfiI为50℃，TaqI为65℃ 。 反应温度过高或过低都会影响酶活性，甚至导致酶失活。 4、DNA的甲基化程度； 限制性核酸内切酶不能切割甲基化的核苷酸序列。 这一特性有特殊用途：①改变某些限制性核酸内切酶的识别序列；②产生新的限制酶识别序列；③保护限制性核酸内切酶的切点；④利用一些同裂酶对甲基化的敏感性不同，研究细胞DNA位点专一性甲基化的程度和分布。 大肠杆菌中的DNA腺嘌呤甲基化酶(dam)在5’GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I