实时荧光定量PCR的原理与应用.ppt

荧光PCR及特点 1、荧光PCR 就是在利用荧光信号检测整个PCR扩增过程，获得在线描述PCR过程动力学曲线。 实时荧光PCR带来的好处是熟悉传统方法的人所无法想象的! 2、特点 Ct值（Threshold Cycle ） C代表Cycle ，t代表threshold： PCR扩增信号进入相对稳定对数增长的最下限，通常设定在S型扩增曲线的增长的拐点处附近。 Ct值的含义：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。 相同模板在同一台PCR仪上进行96次扩增的扩增曲线图 （终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性) Ct值的确定 Ct与初始模板的关系 固定循环数后，荧光信号与模板数成正比 固定荧光信号值后，模板数就与循环数成反比 初始DNA量越多, 荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct 值)越少 起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量 标准曲线： 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。Ct与起始模板量的对数呈反比关系。 PCR扩增过程中引入一系列起始浓度的模板与未知样品同时进行扩增，利用该系列模板的Ct值与已知浓度对数做直线回归得到标准曲线，从而计算未知样品的起始模板浓度。 荧光定量标准曲线 SYBR Green 法 优缺点 对DNA模板没有选择性 ----适用于任何DNA 使用方便 -----不必设计复杂探针 非常灵敏 便宜 优 点 容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性 但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件 对引物特异性要求较高 缺 点 * 800免费电话：800-810-2177 第六章 第二节 实时荧光定量PCR技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR) 提 纲 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量技术的应用 实时荧光定量PCR定义 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 实时荧光定量PCR 原理 实时原理 常 规 PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析 无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测 实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 闭管方式进行，操作简便，杜绝了产物污染源 非平台期检验，重现性好 利用循环阈值（Ct）的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该CT值具有极好的重复性 扩增检测合二为一，降低了传统方法过多人为因素的影响，使检测的自动化水平大幅提高 实时荧光定量PCR原理定量原理 介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值 如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析 实时荧光定量PCR 原理 ----------- 扩增曲线 扩增曲线图： 横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集 荧光基团 荧光检测元件 实时荧光定量PCR 原理 -------荧光阈值 荧光信号阈值 （threshold ）： 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99 真正的信号:荧光信号超过域值 实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值 Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数 C(t) value Ct值的特点： Ct值则极具重现性 实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理 理想的PCR反应：