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凝胶过滤层析实验报告 　　通过实验让学生理解影响凝胶过滤层析的因素　　在生物化学实验中,凝胶过滤层析,也称分子筛层析、排阻层析,是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术。笔者现将凝胶层析的用途及通过实验让学生理解掌握影响凝胶过滤层析的两种因素阐述如下。　　一、凝胶层析的应用广泛　　凝胶层析的应用非常广泛,最主要的应用有以下四种。　　1.脱盐　　高分子(如蛋白质、核酸、多糖等)溶液中的低分子量杂质,可以用凝胶层析除去,这一操作称之为脱盐。　　2.用于分离提纯　　凝胶层析已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强吸附力,可用于除去无离子水中的致热原制备注射用水。　　3.测定高分物质的分子量　　用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内,在同一条件下层析、记录每一分钟成分的洗胶体积;根据物质的洗胶体积,在标准曲线上查出其分子量。　　4.高分子溶液的浓缩　　二、通过葡聚糖凝胶柱层析实验,让学生理解影响凝胶过滤层析的两种因素　　学生通过实验,掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。对于凝胶过滤层析的理论学习,学生普遍感到抽象、难理解。通过实验,可以让学生在实验的过程中,变抽象为直观,变难懂为易懂。在实验开展的进程中,学生可以亲眼观察到凝胶的选择和层柱大小、长短的不同均会对实验结果产生影响。　　1.凝胶的选择,根据实验目的不同,选择不同型号的凝胶　　目前,市售凝胶主要包括:价格便宜的凝胶葡聚糖G-10,分离范围凝胶过滤层析实验报告)050-40050-40050-40050-40050-200　　1,000-6,0001,500-20,0002,500-40,0003,000-60,0005,000-100,00015,000-150,00050,000-20,00060,000-400,000＜10,000-500,000＜10,000-1,500,00010,000-5,000,000　　10,000-15,000,,000-50,000,0001,000,000-150,000,000　　凝胶的选择　　根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍，例如SephadexG-200的吸水量为20，1克SephadexG─200吸水后形成的凝胶体积约40mL。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度细分离效果好，但阻力大，流速慢。一般实验室分离蛋白质采用100-200号筛目的的SephadexG-200效果好；脱盐用SephadexG-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。　　凝胶的制备　　商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大中速膨胀，通常在1-2小时内即可完成。特别是在使用软胶时，自然膨胀需24小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。　　样品溶液的处理　　样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，如含脂类可高速离心或通过SephadexG-15短柱除去。样品的粘度不能太大，否则影响分离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。　　防止微生物的污染　　交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常用的抑菌剂有：　　叠氨钠在凝胶层析中只要用％叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶于水，在20℃时约为40%。它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层析特性，但可干扰荧光标记蛋白质。可乐酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2]在凝胶层析中使用浓度为%。在微酸性溶液中它的杀菌效果最佳，在强碱性溶液中或温度高于60℃时易引起分解而失效。　　乙基汞代巯基水杨酸钠在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为01%。在微酸性溶液中最为有效。重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。　　苯基汞代盐在凝胶层析中使用浓度为%-%。在微碱性溶液中抑效果最佳，长时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀；还原剂可引起此化合物分解；含疏基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。　　除了直接加入抑菌剂，在位消毒和在位清对层析介质和仪器的保养十分重要。SIP的目的是将微生物感染减到最低，绝大多数的微生物可用NaOH以该凝胶的建议流速洗约小时消除。CIP的目的是去除柱床内沉淀的及顽固残留的蛋白。凝胶在使用十次以后，最少做一次CIP。事实上，做CIP时，往往已经包含了SIP，不必再重复。新一代Bioprocess凝胶由于拥有很高的化学稳定性，大都可用至1-2M