基因工程(基因工程的基本条件-载体系统).pptVIP

第二节 基因工程的载体系统 (二)质粒载体(Plasmid) 2. 核糖体结合位点对外源基因表达的影响 SD序列的影响： 一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就 越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱基互补 性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述 四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅度降低 。 Shine-Dalgarno（SD）序列：位于翻译起始密码子上游的6-8个 核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚 基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合， 将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译； SD序列与起始密码子之间的序列的影响： 紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20倍。 SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。 SD序列与起始密码子之间的距离的影响： SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在 核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体 复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。 在很多情况下,SD序列位于AUG之前大约7个碱基处， 在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起 始效率不同程度的降低。 起始密码子及其后续若干密码子的影响： 大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG三 种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50% 而UUG只及AUG的25%。 除此之外，从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至 少这一序列不能与mRNA的5’ 端非编码区形成茎环结构，否则便 会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位； 目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与 启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的。 (四) 密码子(codon) 1. 生物体对密码子的偏爱性 不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因， 对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性。 生物基因组中的碱基含量：在富含AT的生物（如单链DNA噬菌 体fX174）基因组中,密码子第三位上的U和A出现的频率较高;而 在GC丰富的生物（如链霉菌）基因组中,第三位上含有G或C的简 并密码子占90%以上的绝对优势。 密码子与反密码子相互作用的自由能：性中等强度规律 细胞内tRNA的含量 如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少； 如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多； 偏爱密码子的决定因素： 2. 密码子偏爱性对外源基因表达的影响 由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率 具有较大程大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳 动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码 子的正确选择。 一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在 大肠杆菌细胞中获得最佳表达： 外源基因全合成 同步表达相关tRNA编码基因 按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源 基因中不适宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干 扰素以及生长激素在大肠杆菌中的高效表达均采用了 这种方法。 外源基因全合成 对于那些含有不和谐密码子、种类单一、出现频率 较高、而本身分子量又较大的外源基因而言，则选择 相关tRNA编码基因同步克隆表达的策略较为有利。 同步表达相关tRNA编码基因 为了提高人尿激酶原cDNA在大肠杆菌中的高效表达，将 大肠杆菌的这两个tRNA编码基因克隆在另一个高效表达的 质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体 细胞对外源基因高效表达的制约作用。 例如，在人尿激酶原cDNA的412个密码子中，共含有22 个精氨酸密码子，其中7个AGG、2个AGA，而大肠杆菌受 体细胞中tRNAAGG和tRNAAGA的丰度较低。 （五）质粒拷贝数 1. 质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响 目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌 细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常 发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理 代谢最旺盛的阶段。 质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势 必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不 稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降。 2700个外壳蛋白分子 (四)大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA 1.M13噬菌体的生物学特性 生物结构 M13噬菌体的外型呈丝状； M13噬菌体由外壳包