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双荧光素酶报告基因检测原理 　　双荧光素酶报告基因分析　　1.介绍荧光素酶报告基因表达的转录调控常被用来研究培养细胞的生物学特性。荧光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性荧光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性的荧光素酶。　　Dual-Luciferase?双荧光素酶报告基因检测系统中含有在同一细胞中同时表达的两种荧光素酶。通常，报告基因实验中往往会受到各种实验条件的影响，共转染的“对照”报告基因会作为内对照，为试验提供一基准线。实验报告基因经过内参照的处理可以减小细胞活性和转染效率对实验的影响，因此双报告系统减少了外部干扰，使得实验数据更可信。实验中报告基因和对照基因的酶没有种源同源性，萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶对应不同的反应底物，反应中没有任何的交叉干扰。　　萤火虫荧光素酶底物和海肾荧光素酶底物分别与检测试剂反应可以使灵敏度最大化。由于超强的光信号和超高的信噪比，本系统被广泛用于制药和生物技术产业中。双荧光素酶报告基因检测系统适配于各种培养哺乳细胞的培养基，如1640，MEM，DMEM，F12等。这些试剂与被动裂解液所附带的试剂盒，可以从Promega试剂盒中分开，单独使用。　　具有超高灵敏度和超宽线性范围的Veritas?微孔板发光检测仪特别适合DLR报告基因检测系统，Veritas?软件中预装了DLR的检测程序使得安装更为方便，内置自动加样器使得应用更为简单。　　Veritas?微孔板发光检测仪使用荧光素酶检测试剂II(LARII)最低可以检测到1X10-19mol荧光素酶分子，使用StopGlo?试剂可以检测到1X10-18mol海肾荧光素酶分子，检测线性范围分别为8和6个数量级。所有的检测均采用纯化的重组萤火虫荧光素酶(E1701)和纯化的重组海肾荧光素酶。　　图1－3使用Promega公司Dual-Luciferase?双荧光素酶报告基因检测系统，萤火虫荧光素酶(1x10-19到1x10-11mol)和海肾荧光素酶(1x10-14mol)在Modulus?仪上测量结果。　　2.所需器材　　?Veritas?微孔板发光检测仪　　(P/N9100-002)　　?96孔白板(EKScientificEK-25075)　　?Dual-LuciferaseReporter?荧光素酶检测系统(E1980)　　?P200移液器和枪头　　3.实验方案　　试剂制备　　荧光素酶检测缓冲液II和荧光素酶检测底物：使用所提供产品，－20℃储存，可以稳定保存6个月，荧光素酶检测底物可以4℃保存1个月。将荧光素酶检测缓冲液II加入荧光素酶检测底物中，配制DLR工作液，颠倒混合，直到底物彻底溶解。配好试剂最好当天使用，也可以将配好试剂分装，-20°C储存1月，-70℃储存1年。StopGlo?底物和StopGlo?底物缓冲液：使用所提供产品，－20℃储存。　　StopGlo?底物溶解缓冲液：使用所提供产品，低于25℃储存。在玻璃管或者硅化聚丙烯酸树脂管中将　　50×StopGlo?底物稀释成1×StopGlo?工作液。颠倒混合，工作液最好当天使用，也可以将工作液分装，-20°C储存2周。　　被动裂解缓冲液：用去离子水将5x被动裂解缓冲液稀释成1x的，低于25°C保存。　　注：因为荧光素酶活性受温度影响，在定量发光检测过程中Dual-Luciferase?荧光素酶缓冲液II和StopGlo?缓冲液应始终保持室温。混合试剂冻存后再次使用，为确保试剂性能，应在低于25℃条件下溶解。溶解后充分混匀，最简单的方法是室温水浴溶解。　　仪器安装　　双击Veritas图标运行软件；　　从WelcometoVeritas对话框中点击RunPromegaProtocol；　　浏览DLR文件夹，选择合适的检测程序，例如DLR检测中使用的是单注射器那就选择DLRwithoneinjection.；　　点击Options选择需要检测的孔，默认值是预置了Promega操作方案的最佳测量值。但也可以根据自己需要在OtherOptions面板中进行检测时间，延迟时间和加样体积的调整。修改结束，点击ApplyChanges　　创新助手报告　　——主题分析报告　　创新助手平台提供　　北京万方软件股份有限公司　　XX-07-10　　报告目录　　报告核心要素.........................................................................................................I　　一、主题简介.............................................................