纤维素填料的制备和其在超氧化物歧化酶提纯中的应用.docVIP

纤维素填料的制备及其在超氧化物歧化酶提纯中的应用 严蕊，徐知遥，张凌，杨娟，姚静 ?????????????? 武汉大学化学与分子科学学院， 2001级应用化学(3)班， 430072 ? 摘要：利用以纤维素铜氨溶液制备的SEC柱填料， 采用梯度洗脱的方法分离由猪血中提取的Cu 。Zn-SOD。并由紫外吸收法测定其ABS并绘制淋洗曲线以检测分离效果。 关键词：纤维素铜氨溶液， SEC填料， 超氧化歧化酶，， 纤维素柱层析， 梯度洗脱， 紫外吸收。 前言： 超氧化歧化酶(Superoxide Dismutase， 缩写为SOD)， 它广泛存在于各类生物体中[6]。 按其所含金属离子得不同分为3种: 铜锌超氧化歧化酶(Cu 。 Zn-SOD)， 锰超氧化歧化酶(Mn-SOD)和铁超氧化歧化酶(Fe-SOD)。 SOD的反应如下: ????????????? 2O-2+2H+???? H2O2+O2 在生物体内， 它是一种重要的自由基清除剂， 能专一性的清除超氧化物阴离子自由基O-而保护细胞， 能治疗多种炎症， 放射性疾病， 自身免疫性疾病， 并能抗衰老， 对生物体起保护作用。 在猪血液里， Cu 。Zn-SOD与血红蛋白等共存于红血球中。 当红血球破裂溶血后， 用氯仿-乙醇处理血液，使血红蛋白沉淀， 而Cu 。Zn-SOD则留在水-乙醇均相溶液中。 将磷酸二氢钾加入水-乙醇中时， 由于其极易溶于水， 而在乙醇中溶解度很低， 溶液分层明显， 用分液漏斗分出上层具有SOD的含水乙醇相， 再加入有机溶剂丙酮， 使SOD沉淀极性有机溶剂会导致蛋白质脱去水化层， 导致蛋白质颗粒凝集而沉淀。 采用这种方法沉淀蛋白质时， 要求在低温下操作， 并尽量缩短处理时间， 避免蛋白质变性。 Cu 。Zn-SOD的pI值为4。95。 本实验采用尺寸排除色谱(Size Exclsion Chromatography， SEC)分级法避免了以往采用添加沉淀剂逐步沉淀的的分离方法中某些有机沉淀剂导致高分子变性， 从而降低其生物活性的缺点， 这种方法在生物大分子实验室研究和工业生产中得到了越来约广泛的应用[1，2]。 目前， 常用的分级填料大多由胶联葡萄糖， 琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶制成， 由于其价格昂贵[3]， 因此使用来源丰富且价格便宜的纤维素制备色谱柱填料不仅保护环境且节约石油资源。 采用聚己二醇-2000(PEG-2000)和纤维素铜氨溶液共混的方法， 可制得强度很好得再生纤维素改性多孔膜， 其孔径是未共混的纤维素膜的4倍， 达到400A， 这种膜可在不同凝固条件下形成多孔膜， 其孔径可通过加入的水溶性高分子的种类， 分子量和含量进行控制[4]。 在此基础上， 采用该体系己制备了系列多孔色谱填料， 在水和有机溶剂体系中对多糖进行了成功的分级[5]。 实验部分： 一．酶的制备 1．? 取新鲜猪血500ml（已预先加入ml 2。5%草酸钾作为抗凝剂）， 3000转/min离心20min出去上层血浆， 收集红细胞500ml， 加入等体积的0。9%NaCl溶液， 用玻璃棒搅拌充分， 洗涤， 3000转/min离心20min， 弃取上层清夜(如此3次)， 收集洗净的红细胞于1000ml的烧杯中， 加250ml蒸馏水， 将烧杯置于冰浴中搅拌溶血40min以上，得血液700ml。 2．? 往溶血液中缓慢加入4℃下预冷过的95%的乙醇175ml， 然后再缓缓加入在4℃下预冷过的氯仿105ml， 搅拌15min， 试问下3000转/min离心20min， 弃去沉淀， 收集上层清液约500ml， 此为酶的粗提取液。 3．? 往上述液体中加入K2HPO4。3H2O(按43gK2HPO4。3H2O/100ml粗提取液的比例)， 转移到分液漏斗， 震荡后静置分层15min， 收集上层乙醇-氯仿相， 室温下3500转/min离心25min， 弃去沉淀， 得上层清液300ml。 4．? 向上一步所得的液体中加入在4℃下预冷过的丙酮， Cu 。 Zn-SOD就沉淀下来。 室温下3500转/min离心20min， 收集灰白色沉淀。 将此灰白色沉淀溶于5ml蒸馏水中， 在4℃下， 在250ml2。5mmol/L(Ph值为7。6)的磷酸钾缓冲液中透析， 每0。5h更换透析液一次， 共4~5次。 二．纤维素填料的制备 1． 制备Cu(OH)2 ????? 将16。5gCuSO4。5H2O加如132mlH2O， 搅拌加热至沸后， 停止加热， 缓缓加入8ml 25%浓氨水， 并搅拌。 冷却至室温后， 用水将沉淀洗至中性。 倒出清液后， 加入112mlH2O入沉淀中， 冰水浴下加入53ml 20%NaOH溶液并搅拌， 在用水洗至中性， 抽滤得天蓝色湿Cu(OH)2。 2．制备纤维素铜氨溶液 ???