细胞因子与细胞粘附因子的测定教学课件.pptVIP

第一节　生物学测定方法 一、促进细胞增殖和抑制细胞增殖测定法 二、细胞毒活性测定法 三、抗病毒活性测定法 四、趋化活性测定法 五、生物学活性测定方法学评价;第三节 细胞因子与细胞粘附分子测定的临床应用 一、临床应用原则 二、特定疾病诊断的辅助指标 三、评估机体的免疫状态、判断治疗效果及预后 ; 是由活化的免疫细胞及某些基质细胞表达并分泌的活性物质，其主要生物学功能是介导和调节免疫应答及炎症反应，其化学本质是蛋白质或多肽。 ;第一节 生物学测定方法; 1.基于DNA检测的分子生物学测定法： DNA扩增法 RNA印迹法 原位杂交法 核酸酶保护分析 2.生物活性测定法 ;根据细胞因子特定的生物学活性,应用相应的指示系统,同时与标准品对比测定,从而得知样品中细胞因子的活性水平,一般以活性单位(U/ml)表示;以细胞因子依赖性细胞株为靶向，通过观察特定的细胞因子刺激或抑制依赖性细胞株增殖来评估细胞因子的活性水平。 ;直接计数法 简便、直观,但费时、主观因素影响大、难以标准化和自动化 细胞代谢活性测定方法 3H-TdR、125I-UdR掺入法或MTT等比色法 细胞代谢产物测定法 代谢产物荧光强度测定法和指示细胞表面标记或可溶性分子测定法; 通过检测细胞DNA合成的增加或减少来判断细胞增殖的方法。在细胞的增殖过程中，DNA合成的增加使得指示细胞对核苷或碱基的需求增多，若将核苷标记上可以示踪的同位素（3H/125I ），通过检测细胞内的同位素含量，则可反映细胞增殖的程度。;常见细胞因子3H-TdR掺入检测法所需细胞及参考试验条件;特点：不使用放射性核素， 以细胞代谢变化为增殖指征 指示细胞的增殖情况与线粒体代谢活性相关 ;细胞株/原代细胞; 对指示细胞具有破坏作用的细胞因子，若与细胞共育将会导致细胞死亡。因此，待测细胞因子作一系列稀释后加至指示细胞培养体系，以检测培养细胞的死细胞数作为判断指标，死细胞数量与细胞因子的活性呈正比。试验时，与细胞增殖或抑制方法一样，以已知活性的细胞因子标准品为对照。死、活细胞情况可用同位素51Cr释放法判断，或应用台盼兰染色死细胞后直接计数。也可通过结晶紫、萘酚蓝黑、MTT、NBB等着染活细胞，再用脱色液脱出染料后酶标仪比色测定吸光值。死细胞数、51Cr释放量越高或比色测定的吸光值越低，表明待测细胞因子的细胞毒活性则越高。应用系列稀释的细胞因子标准品，制作其活性与剂量关系的标准曲线，以此作为待测品活性的定量测定的基础。;Wish、Hep2/c 人干扰素 L929 小鼠干扰素 Ratec 大鼠干扰素 A549 MDBK 多种族的IFN-α和IFN-γ; TNF-α和TNF-β与同一受体结合，故两者生物学活性相似 用TNF-α与TNF-β特异性中和抗体作阻断试验，以区别两类TNF TNF活性测定靶细胞：小鼠成纤维细胞株L929、L-M、WEHI164.13 注意： 若选用L929细胞，其不宜生长过密。 细胞被某种因素激活后，代谢增强，线粒体脱氢酶活性也增强， 着色也会加深。 MTT染色时，必须考虑待检样品中有无激活靶细胞的因素。;细胞病变程度分为5个等级，即： “0”，表示无明显CPE； “1+”，CPE≤25％； “2+”，CPE为25～50％； “3+”，CPE为50～75％； “4+”，CPE为75～100％。根据病变程度找出CPEI50的标本稀释范围，并以此计算出距离比例和确定IFN效价。 该法操作复杂、影响因素较多，在试验前应对所用的病毒进行滴定。 ;趋化性(chemotaxis)： 诱导细胞向由趋化因子低浓度出向趋化因子高浓度处作定向移动的特性,可采用琼脂糖和微孔小室趋化试验。 化学增活性(chemokinesis)： 细胞因子增强细胞的随机运动能力的特性,可采用琼脂糖小滴化学动力学试验检测。;敏感性较高 特异性不高 操作繁琐 易受干扰;第二节 免疫学测定法;根据抗体性质和特异性不同，夹心法ELISA可分为： 1. PcAb与McAb夹心法 2. McAb与PcAb夹心法 3. 双McAb夹心法 4. 细胞、McAb夹心法;敏感性偏低 不能判断细胞因子的生物学活性。;二、流式细胞分析法;使用流式细胞分析法，可以：;三、酶联免疫斑点试验(ELISPOT或ElisaSpot) ;四、免疫学测定方法学评价;第三节 细胞因子与细胞粘附分子测定的临床应用;一、临床应用原则;细胞因子的检