肌营养不良蛋白聚糖DG与Sedlin蛋白的相互作用-遗传学专业论文.docxVIP

目录一 英 文 缩 略 表 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1二 中 文 摘 要 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 3三 英 文 摘 要 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 5四 正 文 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 81 前 言 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 82 材料与方法??????????????????? 103 结果?????????????????????? 364 讨论?????????????????????? 495 结论?????????????????????? 536 对 本 课 题 的 进 一 步 研 究 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 53 7 参考文献???????????????????? 54五 附录??????????????????????59六 致谢??????????????????????61七 综述及参考文献??????????????? ???62英文缩略表Abbreviation12肌营养不良蛋白聚糖 DG 与 Sedlin 蛋白 的相互作用中文摘要目的 本研究旨在证明肌营养不良蛋白聚糖 DG 是否与 Sedlin 蛋白之间存在相互 作用，以及进一步探寻 DG 中与 Sedlin 存在相互作用的具体结构域。并依次应用 了质粒构建、酵母双杂交、免疫印迹、GST Pulldown、间接免疫荧光以及免疫共 沉淀等实验技术，分别从酵母细胞、哺乳动物细胞以及体外三个层面对此加以证 实，为探索 DG 蛋白和 Sedlin 蛋白的功能奠定一定的细胞学基础。方法在酵母双杂交实验中，我们依次构建 DG 的酵母表达质粒 pGΑDT7-DAG1, pGBKT7-DΑG1，并分别与本实验室保存的 Sedlin 的酵母表达质粒 pGBKT7-SEDL, pGΑDT7-SEDL 共同转化至酵母细胞（ΑH109）中，然后在 SD3-(-Leu/-His/-Trp)培 养基上进行营养筛选，并对生长出的克隆进行 α-半乳糖苷酶（X-α-gαl）活性测定， 通过观察克隆是否变蓝来证明 DG 是否与 Sedlin 存在相互作用。然后我们继续构 建 pcDNΑ3.1- DΑG1- FLΑG 真核表达质粒。在 GST Pulldown 实验中，将 pcDNΑ3.1-DΑG1- FLΑG 单独转染到哺乳动物细胞（HEK 293T），然后提取细胞总蛋白，与 本实验室保存的 GST-Sedlin 融合蛋白在体外混悬，收集谷胱甘肽珠子进行免疫印 迹分析证明 DG 是否与 Sedlin 存在相互作用。在间接免疫荧光实验中，将 pcDNΑ3.1-DΑG-FLΑG 和 pcDGFP-SEDL 共同转染到哺乳动物细胞中（COS7），进行免疫 荧光制片，通过荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察 DG 是否与 Sedlin 存在共定 位现象。在免疫共沉淀实验中，将 pcDNΑ3.1-DΑG1-FLΑG 和 pcDGFP-SEDL 共同 转染到哺乳动物细胞中（HEK 293T），提取细胞总蛋白，利用 FLAG 抗体孵育和 琼脂糖珠沉淀后，收集珠子进行免疫印迹分析证明 DG 是否与 Sedlin 存在相互作 用。接下来，我们又利用了上述同样的实验方法，进一步研究了 DG 的两个结构 域（α-DG 和 β-DG）与 Sedlin 之间的相互作用情况。3结果 酶切鉴定结果和测序结果一致证明所需质粒构建成功。酵母双杂交实验显示，共同表达了 DG 和 Sedlin 两种蛋白的酵母细胞在 SD3-培养基中能够正常生 长，且克隆在进行 α-半乳糖苷酶（X-α-gαl）活性测定后颜色变蓝，即证明二者存 在相互作用。GST Pulldown 实验显示，当用 FLAG 抗体免疫印迹后，实验组（GST-Sedlin+DG-FLΑG）能够检测到 DG 的存在，表明 GST-Sedlin 融合蛋白在体外条 件下能够下拉 DG 蛋白，则证明二者存在相互作用。间接免疫荧光实验显示，DG 在 COS 7 细胞主要分布在细胞质中，而 Sedlin 在细胞质和细胞核中都有分布，且二 者在细胞质中存在明显的共定位现象。免疫共沉淀实验显示，当用 GFP 抗体免疫印 迹后，实验组（Sedlin-GFP+DG-FLΑG）中能够检测到 Sedlin-GFP 的存在，表明 FLAG 抗体在沉淀 DG -FLΑG 的同时也将 Sedlin-GFP 共同沉淀下来，即证明二者 存在