单克隆抗体技术.ppt

单克隆抗体技术 疫苗和抗体的研制，是生物技术发展的永恒主题。 目前在美国单克隆抗体类药物已占FDA所批生物药的3/4。 美国已上市16种单克隆抗体药物 2002年销售额 29亿美元 2005年 90亿美元 我国的单克隆抗体药物市场还处于起步阶段，更谈不上抗体组药物的发展。 抗体体内生成的理论 抗原刺激前，机体具有抗体初级库 抗原刺激后，抗体生成的细胞群体被选择，并发生克隆性增殖。 在抗原的反复刺激下，抗体的V区发生高频率突变，产生高亲和力抗体的细胞被选择，抗体进行类别转换，最终抗体成熟。 植物细胞工程 植物细胞工程基本技术1----组织培养 已分化的组织 愈伤组织 幼根幼芽 完整植株 照片 植物体细胞杂交技术 植物体细胞杂交技术 2.融合形成杂种细胞 为什么番茄—马铃薯不能表现出理想结果 能否把动物和植物细胞杂交？怎么操作？ 对比 它是在PCR技术和Phage Display的基础上实现的。其过程是把用PCR法得到的抗体基因插入丝状噬菌体的DNA，与噬菌体外壳蛋白的基因相连，在辅助噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状噬菌体，抗体分子通过与P Ⅲ或PⅧ相连，在噬菌体表面的一端或分散分布，然后可直接对噬菌体表面的抗体分子进行筛选。 噬菌体抗体库技术 1990年Mc Cafferty等成功地建立了噬菌体表面展示系统，通过将抗溶菌酶单链抗体基因克隆于fd噬菌体基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，利用亲和层析，两轮富集达106倍。该技术的成功给抗体基因的筛选工作带来了革命性的变革。 噬菌体表面展示系统(phage surface display system ) 噬菌体表面展示文库技术的要点: 外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端 将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因 g3或g8 的先导系列的紧靠下游 随机克隆入相应载体形成组合文库 从免疫或未被免疫的B细胞中PCR扩增抗体全套基因片段 用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。 使翻译出的抗体分泌到细菌的周质腔内，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。 筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后，转入大肠杆菌， 该项技术的优点: 将抗体的基因型和表型紧密联系起来; 可绕过杂交瘤技术，不需要复杂的基因工程技术; 抗体基因筛选的范围广; 技术稳定、可靠、生产周期短;可规模化生产; 适用范围广，既可用于抗体制备，也适用于其它蛋白如激素、酶、药物、随机多肽等的生产。 噬菌体抗体库技术的发展具有很大优越性。它简单易行，筛选容量大，效率高，绕过了细胞融合及免疫等步骤，而且在表型一基因型的统一和识别一增殖过程上模拟了B细胞的成熟过程，从而在实际应用上具有很大意义。 脱分化 再分化 1 2 3 4 m m m m 1 2 3 4 1 2 3 4 单抗 细胞融合 取出脾細胞 + 癌細胞 各抗体分开 1 2 3 4 m m m m 1 2 3 4 Y Y Y Y Y Y Y Y Y m 核酸补救合成 m 核酸从头合成 核酸 氨甲喋呤(A) (-) 次黄嘌呤(H)\胸苷(T) TK HGPRT TK- HGPRT- 抗体 -a -b -c -d -a -b -c -d 抗原決定基 BALB/c a b b c d 传统抗体 (抗血清) 是所有抗体的混和 脾脏产生各种 B 細胞 免疫前要先 把抗原作 成乳剂 免疫 抗原 采血后可得传统抗血清 已建立之小鼠 骨髓癌细胞株 由脾脏收集 B 細胞 抗原通常有多个抗原決定基 免疫后 的脾脏 约在两月內 注射五到八次 Ag X -d 细胞融合 -a -b -c -d Ag X Ag X’ ELISA HAT PEG Cell fusion Hybridoma cells 融合瘤细胞 （Subcloning） (确定只有一种细胞) d’ d a b c d a b c d’ + + + + + + + - X -d -c -b -a + - -d NS-1 骨 髓 癌 细 胞 B cell 脾 细 胞 分株培养筛选 筛选 单抗 传统抗体 (抗血清) 试验专一性 对 抗 原 的 反 应 无 法 分 辨 完 全 不 同 d 旧有抗原 d’ 新的抗原 基因工程抗体 1 人一鼠嵌合抗体(Chimeric Antibodies) 人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体