限制性内切酶原理.pptxVIP

限制性核酸内切酶;;; 限制性核酸内切酶分布极广，几乎在所有细菌的属、种中都发现至少一种限制性内切酶。细菌通过自身的限制酶，破坏入侵的外源DNA，从而保护自身。; 30多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵，而这种“限制”病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR I和EcoR II，以及来源于流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）的Hind II和Hind III。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。;;;;什么是回文序列？;II型限制酶; II型限制酶切割DNA后形成粘性末端或平末端分别由错位切和平切形成。能形成粘性末端的酶在基因工程中应用最多。 ;;;;有些限制酶识别的序列不是回文序列。 AccⅠ ???识别切割位点分别是GTAGAC 和 GTCTAC BbvCⅠ 的识别切割位点分别为CCTCAGC和GGAGTCG ;1)? DNA的纯度 2)? DNA的甲基化程度 3)? 酶切消化反应的温度 4)? DNA的分子结构 5)? 限制性核酸内切酶的缓冲液 6) Star活性（星活性）; 限制酶消化DNA底物的反应效率，很大程度上取决于所使用的DNA的纯度。DNA制剂中的含有蛋白质、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS以及高浓度的盐离子等都有可能抑制限制酶的活性。;DNA的甲基化程度;酶切消化反应的温度;DNA的分子结构;核酸内切限制酶的缓冲液;Star活性（星活性）; 消化DNA样品后，需要钝化内切酶的活性，终止反应。 方法： 1）65℃温浴5-10分钟，使酶失活。 2）加入EDTA除去酶分子的镁离子，是使酶失活。 3）加SDS或者尿素使酶解聚沉淀。 4）用等体积的酚抽提酶解产物，提取DNA。;; 基因工程中常用的工具酶有限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、逆转录酶、碱性磷酸酶、末端转移酶、甲基化酶。; 将目的基因导入受体细胞前，需要用相同的限制酶将目的基因和载体切成相同的粘性末端，再通过碱基互补配对的方式，在连接酶的作用下，目的基因和载体完成连接。最后将连接好的重组载体导入细胞。;NNNNNNNNNNNA A GC TTNN ? ? ? NNNG GA T CCNNNNNNNNNNNNNNNNNN ;为什么通常要用两种限制酶？;;可不可以用一种酶切割目的基因和载体？;NNNNNNNNNNNA A GC TTNN ? ? ? NNNG GA T CCNNNNNNNNNNNNNNNNNN ; 基因工程中，很多情况下，基因组中靠近目的基因两侧的碱基并没有合适的酶切位点。怎么办？;; 原核生物的甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。; Dam甲基化酶在 GATC 序列中的腺嘌呤上引入甲基。一些限制酶（如BamHⅠ、BclⅠ、Sau3AⅠ等）的识别位点中含 GATC 序列。 有些限制酶对Dam甲基化的DNA 敏感，不能切割相应的序列，如 BclⅠ。有些限制酶对Dam甲基化的DNA不敏感，如 BamHⅠ、Sau3AⅠ等。;甲基化酶对限制酶的影响： 1.修饰酶切位点。 构建 DNA 文库时，用 AluⅠ（AG↓CT） 和 HaeⅢ（GG↓CC） 部分消化基因组 DNA 后，将得到的片段用 M.EcoRⅠ甲基化酶处理，然后加上合成的 EcoRⅠ 接头，再用 EcoRⅠ来切割时只有接头上的位点可被切割，从而保护基因组片段。 2.产生新的酶切位点 有些酶只识别经过甲基化的序列。DpnⅠ 是依赖甲基化的限制酶， TCGATCGA 受 M.TaqⅠ 处理后形成甲基化(A)产物 TCG*ATCG*A ，其中 G*ATC 即为 DpnⅠ 位点。 ;谢谢观看