大黄欧文氏菌蔗糖异构酶控制产物特异性基序的定点突变.docVIP

基因组学与应用生物学，2011 年，第 30 卷，第 5 期，第 556-563 页 基因组学与应用生物学，2011 年，第 30 卷，第 5 期，第 556-563 页 Genomics and Applied Biology, 2011, Vol.30, No.5, 556-563 研究报告 A Letter 大黄欧文氏菌蔗糖异构酶控制产物特异性基序的定点突变 周兴 1,2 韦星明 2 杨祥开 2 郑元涛 2 庞浩 3 许黎明 2 黄日波 1,3* 1 广西大学生命科学与技术学院, 南宁, 530005; 2 广西科学院生物研究所, 南宁, 530007; 3 生物质能源酶解技术国家重点实验室, 广西科学院, 南宁, 530007 * 通讯作者, HYPERLINK mailto:rbhuang@ rbhuang@ 摘 要 大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici)蔗糖异构酶催化蔗糖异构为异麦芽酮糖和海藻酮糖，具有一个可 能控制产物特异性的 325RLDRD329 基序。本研究以定点突变方法对该基序的带电荷氨基酸进行突变，共构建 R325D、R328A、R328D、R328Q 和 D329N 5 个突变体。通过对突变体的酶学特性及突变体转化蔗糖的产物组成分析， 结果显示所构建突变体的 Km 值上升约 2~5 倍，比活力下降至野生型 SI 比活力的 11.8%~25.3%。HPLC 分析 显示 Arg325 和 Arg328 分别突变为 Asp，导致产物中异麦芽酮糖 / 海藻酮糖的比例从 6.93 分别降至 0.96 和 2.92，并伴随一个未知寡糖出现。Arg328 突变为 Ala 和 Gln 同样导致反应产物中海藻酮糖比例上升，异麦芽酮 糖比例下降。但是突变体 D329N 反应产物比例没有变化。以上结果表明 325RLDRD329 基序对大黄欧文氏菌蔗糖异 构酶的酶活具有重要作用，并对酶的产物特异性产生影响。本研究结果将为该酶的作用机理研究奠定基础。 关键词 蔗糖异构酶, 定点突变, 产物特异性, 大黄欧文氏菌 Site-directed Mutation in a Product-Specificity-Controlling Motif of Sucrose Isomerase from Erwinia rhapontici Zhou Xing 1,2 Wei Xingming 2 Yang Xiangkai 2 Zheng Yuantao 2 Pang Hao 3 Xu Liming 2 Huang Ribo 1,3* 1 College of Life Science and Biotechnology, Guangxi University, Nanning, 530005; 2 Biology Institute, Guangxi Academy of Sciences, Nanning, 530007; 3 State Key Laboratory for Biomass Enzyme Technology, Guangxi Academy of Sciences, Nanning, 530007 * Corresponding author, HYPERLINK mailto:rbhuang@ rbhuang@ DOI: 10.3969/gab.030.000556 Abstract Sucrose isomerase (SI) from Erwinia rhapontici isomerizes surcose to produce isomaltulose and tre- halulose. It has a motif (325RLDRD329) which may control the product specificity. In this study, the charged amino acid residues of the motif have been site-directedly mutated, and 5 mutants (R325D, R328A, R328D, R328Q and D329N) were obtained. By analyzing the enzymatic characteristics of the mutants and the product composition of sucrose conversion catalysed by the mutants, we found that the Km of these mutants increased by about 2~5 folds and the sp