总rna的提取及rt-pcr.pptVIP

RT-PCR技术;一、真核生物基因的表达 真核生物的基因含有大量的非编码区，称为内含子（intron），真正编码蛋白的区段是被内含子隔开的，这些编码区叫做外显子（exon）。真核生物的DNA转录成为RNA之后，经过剪切和拼接，去掉这些非编码区，才形成成熟的mRNA，由mRNA再翻译成蛋白质。;基因;二、RT-PCR技术的应用 ;实验一 Trizol法提取细胞总RNA （一步法） ; ; RNA实验失败的主要原因是RNA酶的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等，只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以建立一个无RNA酶的环境对于制备RNA很重要。;常用的RNA酶抑制剂： 焦磷酸二乙酯（DEPC）：与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合，有高致癌性。（实验准备阶段使用） 异硫氰酸胍、氯仿：提取RNA同时也使RNA酶失活。 RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。（合成cDNA阶段使用） ; 1.在实验室最好有专门的RNA操作区，离心机、移液器、试剂等专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行除菌。 2.相关耗材(Ep管、Tip头)应先用0.1% DEPC水浸泡过夜并高压消毒。也可直接使用厂家供应的无RNase的Ep管、Tip头。 3.金属器械和玻璃器皿应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。;4.塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗 5.配制的溶液应尽可能加入DEPC至终浓度0.1%处理12hr以上，然后用高压灭菌除去残留的DEPC。（不能用DEPC或高压灭菌的试剂，如Tris、DTT等，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌） 6.人的唾液和汗液含有RNA酶，故在操作中应戴手套，避免讲话。; 7.一些组织如脾脏比其它组织含有更多的RNA酶；细菌比哺乳动物细胞含有更多的RNA酶。因此从这些样本中制备RNA应采取更严格的预防措施。; Trizol是一种苯酚与异硫氰酸胍(GTC)的混合物，异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离。加入氯仿可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚促使RNA进入水相，离心后，RNA保留在水相中，DNA和蛋白质保留在有机相中。转移水相，加入异丙醇沉淀RNA，从而得到纯化的总RNA。;准备试剂：Trizol, 氯仿，异丙醇，DEPC水，70℅乙醇(需用DEPC水配制) Trizol的用量： 组织 l ml／50－100mg ; 细胞 l ml／10cm2培养瓶面积或106个细胞 ; 操作步骤;小心吸取上清，转移至新的1.5ml Ep管，加入等体积的异丙醇，15~30℃放置10min ? 12000rpm离心15min，小心去上清，加入1ml 70%乙醇，震荡数秒，8000rpm离心5min 小心去上清，室温干燥5min，加入10ul DEPC水，打匀 ? 55℃水浴10分钟助溶;RNA保存： 溶解在无RNAase的水或TE中，在-70℃或更低温度中保存时间在一年以内，但避免反复冻融，应分装保存。 从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需溶解在去离子甲酰胺中存于-70℃，至少可以保存一年。需使用RNA时，可以加入NaAc至终浓度0.3M，12000×g离心5分钟，70%乙醇洗涤后再用无RNAase的水或TE溶解。;RNA提取结果的鉴定： 紫外分光光度法测定260/280nm比值大约为2.0，如果比值过低，表明有蛋白质或酚污染。 RNA浓度(μg/ml)=OD260×稀释度×40。 ;RNA电泳鉴定 通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA是否有降解 电泳检测结果有三条清晰的rRNA 带：28S，18S和5S （普通的1%琼脂糖凝胶电泳也可用于鉴定，电泳槽用去污剂处理，水冲干净，用新鲜的电泳缓冲液）;Total RNA;实验二RT-PCR; cDNA的合成包括第一链和第二链cDNA的合成： 第一链cDNA的合成是以mRNA为模板，反转录为cDNA，由逆转录酶催化，该酶合成DNA时需要引物引导，常用引物是oligo dT、随机引物或基因特异引物（GSP）。 第二链合成是以第一链为模板，由DNA聚合酶催化。;RNA 模板;oligo (dT)18; 两步法RT-PCR;cDNA第一链的合成;操作步骤：; 一步法RT-PCR; 方案示