马立克氏病毒感染鸡羽髓及皮肤蛋白质组学研究-预防兽医学专业毕业论文.docxVIP

陈欣虹：马市克病毒感染鸡羽髓及皮肤蛋白质组学研究马立克氏病毒感染鸡羽髓及皮肤蛋白质组学研究 陈欣虹：马市克病毒感染鸡羽髓及皮肤蛋白质组学研究 马立克氏病毒感染鸡羽髓及皮肤蛋白质组学研究 研究生：陈欣虹 导师：秦爱建教授 摘 要 马立克氏病毒(Marek’S disease virus，MDV)属疱疹病毒科，a疱疹病毒亚科， 它是鸡的一种高度传染性肿瘤疾病——马立克氏病(MD)的病原，该病以外周神 经以及性腺、虹膜、各种内脏器官、肌肉和皮肤的单核性细胞浸润和肿瘤形成为 特征。MDV致病机理非常复杂，病毒感染与肿瘤产生相互影响。MD是兽医学、 基础科学及比较医学研究的良好材料。MDV致瘤机理是MDV的研究中最令人感兴 趣的，且MD是动物癌症中第一个能用疫苗来预防的疾病，它已成为人类癌症的一 个理想的研究模型。此外，MDV是严格的细胞结合毒，唯一可以获得感染性的、 脱离细胞的带囊膜病毒的组织是羽毛囊上皮细胞(Feather follicle epithelium，FFE)， 游离的有囊膜的病毒在FFE形成后，通过皮肤或羽屑释放到环境中，成为感染其他 鸡的传染源。但病毒在皮肤羽囊上皮细胞中如何组装成完全病毒，病毒蛋白与宿 主蛋白如何相互作用，目前仍知之甚少。本研究对感染MDV鸡皮肤和羽髓进行了 蛋白组学分析，通过质谱鉴定了病毒感染后表达差异显著的蛋白和新出现的蛋白， 并对这些蛋白进行了生物信息学分析。本文首次从蛋白水平上报导了鸡皮肤和羽 髓对MDV感染的宿主应答，可望在分子水平为研究MDV游离病毒形成和病毒致病 机理提供新的资料。 1．雏鸡感染马立克氏病毒的临床观察与病理鉴定 56只一日龄SPF雏鸡腹腔注射感染马立克氏病毒(MDV)超强毒株RBlB II II 扬州大学博士学位论文 (RBlB．CEF 0．2mL，1000PFU)，对照组40只鸡注射同等体积DMEM培养基。从 感染后7天起(7dpi)，每隔一周每组取4只鸡扑杀，采血分离血清、采集羽毛、 皮肤及内脏等，冻存于一70。C。试验结果发现SPF鸡感染两周后开始出现可见临床 症状如消瘦、毛色苍乱等，用PCR可以从羽毛扩增出病毒基因pp38；3周后有劈 叉、瘫痪等现象，剖检可见脾、肾等内脏肿大，法氏囊萎缩；4．5周后症状更加明 显，并陆续有鸡死亡，剖检可见多数鸡内脏产生肿瘤，病理切片显示皮肤及羽毛 有淋巴细胞浸润，琼脂扩散实验证实感染鸡血清中产生了MDV抗体，羽毛中含 MDV抗原。这些结果说明SPF鸡已成功感染MDV，并发展成马立克氏病(MD)， 为进一步开展羽囊和皮肤蛋白质组学研究提供了条件。 2．鸡羽髓蛋白二维电泳方法的建立 禽类的羽髓是多种病毒复制、包装以及释放的部位。其取样十分方便，是研 究病毒复制、基因表达及宿主应答等的良好样本。本研究从SPF鸡羽根挤出羽髓， 并提取其蛋白进行二维电泳(two．dimensional electrophoresis，2．DE)，对不同裂解 液、IPG胶条pH值范围、一向等电聚焦(IEF)条件、二向SDS．聚丙烯酰胺凝胶 电泳(SDS．PAGE)凝胶浓度、蛋白上样量、染色方法等进行优化。结果表明以400 U g羽髓蛋白样品，用17em，pH 5．8 IPG胶条进行2-DE，第一向IEF聚焦条件为 8000V，60000伏特小时，第二向SDS．PAGE凝胶浓度为11％，胶体考染法染色时 可获得图谱最佳。2-DE图谱经PDQuest8．0．1分析，可检测到700个以上蛋白点， 不同鸡只来源样本间的匹配率大于92％。本研究建立了鸡羽髓蛋白重复性较好、 分辨率较高的二维电泳方法，该方法的建立为利用蛋白质组学方法研究禽类病毒 的致病机理及病毒与宿主的相互作用等提供了技术基础。 3．马立克氏病毒感染鸡的羽髓差异蛋白质组学研究 羽毛是细胞游离马立克病毒释放的部位，是感染其他鸡的传染源，同时也是 检测马立克氏病毒非常方便的材料，但感染马立克氏病毒鸡羽髓中宿主基因表达 的变化及对病毒感染的应答仍不清楚。本研究用SPF鸡人工感染马立克氏病毒超 强毒R_B1B株，感染后21天采集鸡羽毛，按第二章所述方法提取羽髓蛋白，以17cm， 陈砍虹马立克病毒感染鸡羽髓及皮肤蛋白质组学研究 陈砍虹马立克病毒感染鸡羽髓及皮肤蛋白质组学研究 III pH5．8的IPG胶条进行二维电泳，以未感染病毒的SPF鸡羽髓蛋白为对照，使用 PDQuest软件对二维电泳图谱分析，寻找表达差异蛋白。结果攻毒组和对照组之间 表达差异大于两倍的蛋白点有41个，其中攻毒组表达上调的蛋白点25个，下调 的蛋白点7个，新出现的蛋白点有9个。选取差异较大的25个斑点进行质谱鉴定， 共成功鉴定了21个斑点，对应于20个蛋白。分别是：载脂蛋白AI(apolipoprotein AI)、免疫球蛋白入链