黄瓜线粒体类质粒pC3的性质及分子标记研究-遗传学专业毕业论文.docx

南开大学博士研究生毕业(学位)论文 南开大学博士研究生毕业(学位)论文 中文摘要 摘要 在一些真菌和高等植物的线粒体中存在主基因组以外的类似质粒的小核酸分子． 在高等植物中的类质粒有三种类型：环形DNA，线形DNA和线形RNA。类质粒的 分布有局限性，到目前为止，只在玉米(zea mays)、水稻(Oryza sativa)、甜菜(Beta vulgaris)、蚕豆(Vicia raba)和黄瓜(Cucumis sativum)等11种植物中发现有类质粒， 在同一种植物中有的品种有类质粒，有的品种则没有类质粒。虽然．一些类质粒的序 列和性质已经被了解，但是，有关类质粒的功能和起源几乎仍然未知。 黄瓜属于葫芦科植物，在高等植物中葫芦科线粒体基因组最大而且最复杂．该科 线粒体基因组的膨胀机制是真核生物线粒体进化研究中一个值得关注的问题。黄瓜线 粒体类质粒的发现及其性质研究，对于了解真核生物核、叶绿体和线粒体基因组之间 的遗传信息传递具有重要的意义。 本文应用琼脂糖凝胶电泳、米曲霉来源的SI核酸酶处理和电子显微镜观察，对黄 瓜线粒体3种类质粒进行了形态和大小鉴定，根据其分子由大到小，依次命名为pCl、 pC2和pC3。将染色后的琼脂糖凝胶拍照，因为其负片中的爆光密度与凝胶的荧光密 度成正比，所以通过ImageMasterVDS自动扫描系统，对负片中的类质粒进行密度扫 描，根据类质粒密度值估计在相同条件下类质粒间的相对拷贝数比值。结果显示，pC3 的拷贝数明显高于pC!和pC2，不同黄瓜品种之间存在类质粒间相对拷贝数比值的差 别。 由于类质粒pC3不能被限制性核酸内切酶消化成线形，无法通过常规的方法进行 克隆。需要寻找新的克隆途径。文献报道，在合适的条件下，米曲霉来源的S一核酸 酶能够将环形DNA超螺旋分子消化成线形结构，然而，Sl核酸酶的这种作用没有得 到广泛关注。本文以pUCl9为材料，建立了sl核酸酶将小环DNA分子从超螺旋结 构转变成线形结构的最佳反应条件．以及相应的克隆小环DNA分子的新方法。通过 8i核酸酶的作用成功地获得了纯化的类质粒pC3，将线形pC3的Y-OH末端加一个 腺瞟呤尾巴后与pMDIS-T载体连接，然后以E coli JMl09为宿主进行转化。重组子 中的插入片段经Southern杂交和限制性酶切长度加以鉴定。 重组子插入片段的核苷酸序列测定结果证明pC3的长度为537bp，pC3是迄今在 真核生物中发现的最小的环形DNA类质粒，其核酸序列已被GenBank鉴定和收录(收 录号为AF522195)。在pC3中存在大量的正向和反向短重复序列．这些重复序列占 pC3分子总长度的40％。pC3中的G+C含量为44．9％，该比值与高等植物线粒体基因 南开大学博士研究生毕业(学位)论文 南开大学博士研究生毕业(学位)论文 中文摘要 组和环形DNA类质粒的平均G+C含量一致。虽然．pC3中有一些短的ORF，但Northern 杂交没有检测到转录物。Southern杂交显示，pC3与所有黄瓜品种的核DNA和叶绿 体DNA有同源性；而pC3与线粒体主环DNA的同源性及程度则因品种而异：3种 黄瓜线粒体环形DNA类质粒彼此之间都同源。 本文研究了细胞核遗传背景及黄瓜苗生长的培养条件对类质粒稳定性的影响。当 以有类质粒的“滓研4号”为母本，以4种无类质粒品种分别为父本进行种问杂交。 杂交的Fl代核基因型与母本有差异，结果显示，虽然，所有核基因型的改变以及各 种培养条件的变化都没有造成黄瓜线粒体类质粒的丢失，但是。类质粒间拷贝数比值 发生不同程度的改变。 通过电镜观察研究pC2和pC3的DNA复制中间体的形态，结果发现pC3样品中 有滚环复制特有的。型DNA分子，在pC2样品中出现0型DNA分子。迸一步对琼 脂糖凝胶电泳后的3种类质粒进行非变性转膜和Southern杂交，因为只有滚环复制才 能形成单链DNA，其单链DNA可以直接转移到尼龙膜上并与探针杂交。分别以pCl、 pC2和pc3为探针杂交，结果显示，只有pC3样品中有杂交信号。电镜和非变性转 膜杂交结果表明，pC3是以滚环方式复制，而pC2和pC3很可能以0方式复制。 本文以线粒体类质粒为分子标记研究了黄瓜线粒体基因组的遗传方式。以有线粒 体类质粒的“津研4号”为母本，以没有类质粒的5种黄瓜品种为父本进行杂交， Southern杂交发现，pC3与5种杂交Fl代线粒体DNA的类质粒位置有很强的杂交信 号。这说明黄瓜线粒体存在母系遗传，在此以前尚未有黄瓜线粒体母