棉花遗传多样性研究及抗黄萎病相关基因的克隆与分析-作物遗传育种专业毕业论文.docx

摘要遗传多样性的量化与分类是收集和利用种质资源的重要前提。利用简单重复序 摘要 遗传多样性的量化与分类是收集和利用种质资源的重要前提。利用简单重复序 列(SSRs)和随机扩增多态性DNAs(RAPDs)两种分子标记对来自我国各个棉区的30 份陆地棉转基因种质材料进行了遗传多样性分析，材料包含有我国的现有的三种转 基因类型。利用NTSYS—pc 2．10统计分析软件，采用Jaccard’s相似系数UPGMA法 进行聚类。结果表明三类转基因材料大致分为不同的两类，而且不同棉区的转基因 材料交叉分布。相似系数分析表明，我国转基因材料的遗传多样性相对较为丰富。 同时利用这两神分子标记对31份陆地棉种质资源进行了遗传多样性分析，其中 14份材料是最近从美国和伊朗引进。从有多态性的21个RAPD引物和18对SSR 引物中共获得117个多态性位点。利用NTSYS—pc 2，10统计分析软件，采用Jaccard’S 相似系数UPGMA法进行聚类。结果表明从国内来的17份材料部分聚为一类，从国 外来的14份材料大部分聚为另一类，其他材料相间排列：分别对31份材料的相似 系数和来自中国的17份材料的相似系数进行了比较分析，国内材料相对于新引进的 国外材料的遗传多样性水平稍高，国内和国外材料之间的遗传差异较大。这说明扩 大不同地区间种质资源的交流和引进种质资源可以丰富本地材料的遗传多样性。观 阶段积极引进、正确评价和有效利用种质资源仍具有重要意义。 黄萎病是由大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae kleb．)引起的土传性真菌维管束病 害，近年来在世界上对棉花和许多作物造成严重的产量和品质损失。本研究以对黄 萎病有抗性的海岛棉Pima 90为材料，利用改良的异硫氰酸胍法抽提棉花根组织材 料的总RNA。在幼苗接种黄萎病病原菌后2、4、8、12、24、48、72和96 h分别取 幼根以抽提棉花总RNA。以未接种病原的棉花eDNA为驱动方，以接种病原的棉花 cDNA为试验方，利用SSH法对接种瘸原后的棉花eDNA进行差减杂交以分离对抗 病反应的基因。SSH文库包含534个克隆，以M13引物对扩增插入片段进行PCR 扩增，电泳结果显示插入片段大小从0．2至1．2 kb不等，平均大小为O．5 kb。将克隆 中的插入片段点种于尼龙膜上，分别以病原诱导前后的总cDNA为探针进行反向 Northern杂交。对88个在海岛棉的抗病反应中表达有差异的克隆进行了测序并对测 序结果在NCBI上利用Blastn和Blastx进行序列相似性分析。结果表明大部分阳性 克隆与拟南芥、棉花等多个物种不同逆境条件下诱导的相关基因或表达序列相同或 同源。鉴定到一些与抗病反应相关的基因如棉花病程蛋白家族10、拟南芥抗病反应 蛋白家族、谷胱甘肽S转移酶等。同时分离到一些参与转录和信号转导的因子如 MYB转录园子家族、转导蛋白家族WD-40 repeat和Cys2／His2类的锌指蛋白等。 两个与植物激素调节相关基因同源的EST可能在棉花抗病反应中起作用。SSH文库 的构建和分析将有助于了解棉花抗黄萎病反应的分子机制。 从SSH文库中分离到两个海岛棉受黄萎病诱导表达的基因GbPR』和GbPR 2。 GbPR』转录本长为701碱基，包含一个528碱基的完整开放阅读框。它编码一个 4 176个氨基酸的多肽，其分子量为18．9 176个氨基酸的多肽，其分子量为18．9 kD，等电点为6．34。利用GeneBank的BlastX 进行同源性序列分析时发现其与拟南芥抗病反应相关蛋白家族成员有46％的同源性 且具有相同的保守结构域Dirigent。生物信息学分析表明，GbPR l的N端具有一典 型的信号肽序列。跨膜结构预测表明该蛋白的N端和C端分别有一跨膜结构，且两 者的方向都为由胞内向胞外。蛋白N端的跨膜结构末端与其信号肽序列位置相重叠。 对该蛋白质功能预测表明其功能与生物的免疫反应有关。Northern杂交和RT-PCR 分析表明其在海岛棉中受黄萎病诱导表达。GbPR 2转录本长为804 bp，包含一个 522 bp的完整开放阅读框。它编码一个174个氨基酸的多肽，其分子量为18．6 kD， 等电点为6．59。(mPR 2与拟南芥抗病反应相关蛋白家族成员有39％的同源性但具 有相同的保守结构域Dirigent。生物信息学分析表明GbPR 2与GbPR l具有类似的 功能和信号肽序列。GbPR l和GbPR 2的最大差异位于其N端，GbPR 2没有检测到 典型的跨膜结构。MIC-3与棉花线虫抗性相关，受线虫诱导表达，但在本实验的SSH 文库中高频出现。Northem杂交表明其也受黄萎病诱导，MIC-3可能是棉花基础抗 性反应中的一个因子。 病程相关蛋白(PR)．10