抗菌肽OncorhyncinⅡ的克隆及其在毕赤酵母中的表达、纯化及抗菌机制分析-微生物与生化药学专业毕业论文.docx

I1mY㈣1m9吣3帅删5m1吣411l＼1啷 I 1mY㈣1m9吣3帅删5m1吣411l＼1啷 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名： 壶煎 日 期： 兰型：鱼：兰暨 ．_-J_ 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 (保密论文在解密后应遵守此规定) | ／。 论文作者签名：壶趣 导师签名： ／加a 2 期： 3饥不乃 ／j ∥羹只呈硕士学位论文目 ∥羹只呈硕士学位论文 目 录 中文摘要 1 ABSTRACT ． ． ．4 符号说明 7 第一章前言 1抗菌肽的来源 ．9 2抗菌肽的结构 10 2．1一级结构 10 2．2二级结构 1 1 3抗菌肽的分类 11 4抗菌肽的生物学活性及作用机制 ll 4．1抗菌作用 1l 4．2抗肿瘤作用 l 3 4．3抗真菌作用 14 4．4抗病毒作用 ．14 4．5抗寄生虫作用 一14 4．6抗氧化作用 l 4 5抗菌肽的应用 ．1 5 5．1在医药行业的应用 15 5．2在饲料添加剂行业的应用 ．．1 6 5．3在食品和化妆品行业的应用 17 5．4在转基因领域的研究 17 6抗菌肽重组表达系统 18 6．1大肠杆菌表达系统 l 9 6．2酵母表达系统 1 9 7本课题拟解决的问题 20 第二章抗菌肽Oncorhyncin II基因的克隆及毕赤酵母表达载体的构建 1 材料 。22 1．1菌株及载体 22 。羹只孥硕十学位论文1．2培养基 。羹只孥硕十学位论文 1．2培养基 22 1．3分子生物学试剂 ．23 1．4常用试剂配制方法 ．23 1．5常用的仪器设备 ．24 2实验步骤与方法 24 2．1目的基因的获得 ．24 2．2目的基因的克隆 ．26 2．3毕赤酵母表达载体pGAOnlI的构建 27 2．4表达OncorhyncinlI毕赤酵母工程菌株的构建 ．32 4实验结果 36 4．1目的基因的获得 ．36 4．2毕赤酵母表达载体pGAOnlI的构建 37 4．3表达Oncorhyncin II的毕赤酵母工程菌株的构建 ．．41 5讨论 43 第三章抗菌肽Oncorhyncin II在毕赤酵母中表达生物学活性及发酵液稳定性研 究 1材料 一46 1．1菌株 。46 1．2试剂 46 1．3培养基的配制 ．．46 1．4常用试剂配制方法 ．47 1．5主要仪器设备 。47 2实验步骤与方法 47 2．1重组抗菌肽的表达及鉴定 47 2．2重组抗菌肽抗菌活性的初步研究 49 2．3抗菌肽稳定性研究 ．5l 2．4重组毕赤酵母摇瓶发酵条件优化 52 3实验结果 53 3．1重组抗菌肽Oncorhyncin II在酿酒酵母工程菌中的表达 53 3．2重组抗菌肽抗菌活性研究 53 2 厶羹只呈硕十学位论文3．3对发酵液中抗菌肽的稳定性研究 厶羹只呈硕十学位论文 3．3对发酵液中抗菌肽的稳定性研究 ．．58 4讨论 64 第四章抗菌肽Oncorhyncin II的分离纯化及性质研究 l实验材料 66 1．1试剂材料 ．66 1．2仪器设备 66 2实验方法 66 2．1抗菌肽Oncorhyncin II的纯化 66 2．2 Bradford法测定纯化后目的多肽Oncorhyncin II含量 67 2．3抗菌肽Oncorhyncin II的稳定性试验 67 2．4抗菌肽Oncorhyncin II对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)测定 ．68 3实验结果 ．68 3．1抗菌肽Oncorhyncin II的纯化 。68 3．2抗菌肽Oncorhyncin II的活性 70 3．3抗菌肽Oncorhyncin II的浓度测定 72 3．4抗菌肽Oncorhynein II的稳定性试验 72 3．5抗菌肽Oncorhyncin II对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)测定 。73 4讨论 74 第五章抗菌肽Oncorhyncin II的抗菌机制研究 l实验材料 ．．76 1．1试剂材料 ．76 1．2常用试剂配制 ．76 2实验步骤与方法 ．76 2．1抗菌肽的抑菌动力学研究 ．76 2．2观察抗菌肽Oncorhyncin II对金黄色葡萄球菌细胞形态的影响 78 3实验