玫瑰类黄酮合成相关基因的克隆和功能解析-观赏园艺学专业毕业论文.docxVIP

华中农业大学2016届博士研究生学位论文3．5 RrDFRl、确DJ啵转基因烟草功能分析．253．6 DFR／FLS的表达与花青素、黄酮醇积累的关系274讨{仑．294．1植物中FLS和DFR序列具有高度的保守性294．2花色的形成与黄酮醇、花青素积累有关294．3 FLS和DFR的竞争性表达导致红花白花分化。304．4 FLS和DFR的表达与黄酮醇、花青素积累有关．．315结论．3 1第三章玫瑰RrANR基因提高烟草抗逆性机制研究321引言．322材料与方法．322．1植物材料与培养条件322．2 RrANR、删卯克隆与超量表达载体构建322．3烟草遗传转化332．4原花青素、花青素、ABA含量测定．332．5缺水、H202以及MV处理．332．6生理指标测定及组织学染色332．7外源PAs和ABA对烟草幼苗处理342．8转录组测序342．9 qRT-PCR分析。342．10统计分析．343结果与分析．353．1 RrANR生物信息学分析353．2超表RrANR烟草原花青素、花青素含量分析．373．3脱水下月州撇抗性分析．393．4 H202处理下RrANR抗性分析．403．5Ⅲ处理下R以舰抗性分析。413．6转录组数据分析433．7 ABA合成以及ROS相关基因在转基因烟草中上调表达．463．8外源PAs处理可以促进ABA合成483．9 M盱生物信息学分析5011万方数据玫瑰类黄酮合成相关基因的克隆和功能解析3．10 NtABF转基因烟草超表达分析．523．11 NtABF超表达能够增强烟草耐脱水能力．533．12删砑超表达可以促进抗氧化酶基因的表达．554讨论!；!；4．1转RrANR烟草促进原花青素合成．554．2转RrANR烟草提高抗氧化性．564．3超表RrANR引起基因在转录水平发生变化．564．4外源PAs和内源PAs均能上调ABA合成以及抗氧化系统相关基因表达574．5外源ABA可以促进NtABF和抗氧化系统基因的表达584．6转NtABF增强烟草的抗氧化性．585结论58第四章研究展望．60参考文献61附录1．76附录2．87致谢．88III万方数据玫瑰类黄酮合成相关基因的克隆和功能解析摘要玫瑰(Rosa rugosa Thunb．)是一种具有重要经济价值的观赏植物，其花色艳丽、 香气溢人。玫瑰花瓣是提取香料的重要材料，玫瑰精油因价格高产量低，被人们誉 为液体黄金。除此之外，玫瑰花还具有一定的消炎，活血，抗氧化等。然而目前对玫瑰的研究主要局限栽培生理和新品种选育上，随着玫瑰转基因体系的成熟，利用 生物技术提高玫瑰产品附加值成为可能。本课题以玫瑰为材料研究类黄酮合成的分 子机制。我们从玫瑰花瓣中分离得N--氢黄酮醇还原酶(鼢DFRJ)、黄酮醇合成酶 (尺吼S』)和花青素还原酶(删懈)并对它们的功能进行了深入研究。主要研究结果如下： 1通过对玫瑰、野蔷薇、桃、香石竹、杜鹃、山茶以及矮牵牛7个物种的红花白花 进行色素成分分析，发现红花和白花中都能检测到黄酮醇，而花青素在白花中几乎 检测不到。通过对红花白花中类黄酮合成相关基因的表达分析，表明FLS和DFR 的竞争性表达与花青素和黄酮醇的积累有关。为了进一步阐明这种调控规律的作用， 我们从玫瑰、矮牵牛和桃中分离了FLS基因，从玫瑰和矮牵牛中分离DFR基因。烟草转基因结果表明，超表儿S能够增强黄酮醇的合成，减少花青素的积累，从而使转基因烟草花色由红色变为白色：相反，超量表达DFR基因，抑制内源NtFLS的表 达，促进花青素合成。基于上述结果，我们认为FLS和DFR对共同底物的竞争，分 别实现黄酮醇和花青素的合成，从而决定红白花颜色的分化。 2利用FPNI．PCR技术从玫瑰中分离得到RrANR，构建超量表达载体转化烟草。转 基因烟草花色变白，原花青素和ABA含量增加，抗氧化能力增强。通过对RrANR 转基因烟草和未转基因烟草转录组测序结果的分析，结果表明转基因烟草中有1586个基因上调表达，其中包括相关抗逆基因和次生代谢物合成的相关基因，特别是 ABA途径和抗氧化酶系统。为了进一阐明RrANR提高植物抗逆性的分子机理，从 烟草中分离了NtABF。超表达NtABF显著提高植株抗逆性以及抗氧化酶相关基因的 表达。外源PA和ABA处理同样可以上调NtABF和抗氧化酶相关基因的表达。上述 结果表明超量表达RrANR提高植物抗性是通过活性氧的清除和ABA信号实现的。关键词：玫瑰；DFR；FLS；花青素；黄酮醇；ANR；原花青素；ABA；ABF；抗逆性；万方数据华中农业大学2016届博士研究生学位论文AbstractRose(Rosa rugosa)has an important economic value、Ⅳi廿l brightly colored flowers and f