面神经离断伤后面神经管内神经水肿及AQP1表达变化情况的实验分析-外科学专业毕业论文.docxVIP

面神经离断伤后面神经管内神经水肿及 面神经离断伤后面神经管内神经水肿及 AQP1 表达变化情况的实验研究 - - 1 - 摘 要 【研究背景】 面神经自茎乳孔穿出颞骨岩部后，由于其走行表浅且解剖位置特 殊，易受到面部外伤或临近区域手术的损伤，导致由其支配的面部表情肌部分或完全 的功能障碍，对患者的身心及生活造成重大影响[1]。因此，长期以来，面神经的损伤 修复机制一直是各相关学科研究的热点之一，其研究的主要方向通常围绕于物理、化 学以及生物因素所带给神经元及其轴索的直接损伤[2-3]。而对于各种致伤因素所导致 的面神经继发性水肿的形成机制，以及在曲折狭窄且坚硬的面神经管内诱发类似于 Bell’s 面瘫时的“水肿－缺血－水肿”的恶性循环所带来的伤害的可能性却研究甚少。 水通道蛋白（aquaporins, AQPs）是一组以介导细胞水转运为主要功能的膜蛋白家族， 至今发现有 AQP0～12，共 13 个成员，分布于全身各个组织器官，并被证明与各个 组织器官的水肿形成和消除有密切关系[4]。其中，在周围神经系统中，目前发现主要 表达分布有 AQP1 蛋白[5]，但其具体的功能及作用机制尚不清楚。本课题研究并初步 确定了 AQP1 在面神经管内的表达分布情况，并对面神经离断伤后在各个不同时间点 面神经管内继发性水肿程度以及 AQP1 蛋白表达水平的变化进行了观察，初步探讨了 面神经水肿与 AQP1 蛋白变化水平的关系，为今后进一步明确面神经水肿性损伤的作 用和机制提供理论依据。 【目的】（1）采用耳下切口入路构建小鼠面神经离断模型，并通过行为学观察、 电生理检测，以及面神经核团组织切片观察对其预后进行评估，为后续实验提供可靠 而稳定的动物模型；（2）采用解剖学观察和组织切片染色的方法，明确面神经管及面 神经颞骨段的解剖学特征，并对面神经离断术后不同时间点面神经迷路段神经水肿程 度的变化情况进行观测；（3）采用免疫组化染色、Western Blot 以及 RT-PCR 的方法， 对 AQP1 在面神经组织上的表达分布及在面神经离断术后不同时间点的蛋白及基因 表达变化情况进行观测；（4）探讨 AQP1 蛋白对面神经管内面神经水肿的可能性作用。 【方法】 （1）小鼠面神经离断模型的构建及评估 1、对 BALB/c 小鼠的面神经走形及其毗邻组织行解剖学研究，明确切口入路位 置及手术方法； 2、将 20只 BALB/c 小鼠随机分为手术组及假手术组，并以左侧为手术侧，右侧 为自身对照侧，利用耳下切口入路构建小鼠面神经离断模型； 3、于术前、术中及取材前检测手术侧面神经的复合肌肉动作电位（compound muscle action potential, CMAP），并分别于术后 1 天、2 天、7 天、14 天、28 天对两 组小鼠面神经功能进行行为学评分； 第二军医大学博士学位论文 4、于术后 28 天，对两组小鼠进行灌注、固定后，取包含面神经核团区的脑干部 位行系统连续冰冻切片，每 5 张取 1 张，并对其行甲苯胺蓝（toluidine blue）染色， 对核团区神经元进行计数，并以每只动物一套切片，对手术侧与对照侧神经元总数进 行 student-t 检验，P＜0.05，认为有显著性差异。 （2）面神经管内神经水肿程度的变化趋势 1、通过解剖学研究面神经管内各节段神经的走形，并对正常小鼠的脱钙头颅颞 骨段进行连续冰冻切片，观察面神经管各节段的形态，明确实验观测评价部位； 2、将 30 只 BALB/c 小鼠按术后处死取材的时间不同，分为 A（术后即时）、B （术后 6 小时）、C（术后 1 天）、D（术后 3 天）、E（术后 5 天）和 F（术后 7 天） 组，每组 5 只。采用耳下切口入路构建面神经离断模型，并根据分组时间进行灌注、 固定，切取其双侧颞骨段进行脱钙； 3、对各组脱钙头颅颞骨段观测部位进行连续冰冻切片，取相邻的 2 张，分别组 成两套切片，一套用于观测面神经水肿情况；将另一套归入下一阶段实验，用于观察 AQP1 蛋白原位表达变化情况； 4、分别测量各组观测部位切片的面神经与面神经管截面积的比值（FN/FC），并 对其值行上述统计学方法分析，了解面神经离断后面神经管内神经水肿程度的时相性 变化趋势。 （3）面神经管内 AQP1 的表达与变化趋势 1、解剖获取面神经颞骨段游离神经组织进行组织切片，并结合上一阶段实验获 取的各时间组的组织切片行 AQP1 染色，观察 AQP1 的分布和表达，初步判断 AQP1 的时相性变化； 2、取 30 只 BALB/c 小鼠，采用与上一阶段实验相同的分组方法，将其分为 A、 B、C、D、E 和 F 组，每组 5 只。采用耳下切口入路构建面神经离断模型，并根据分 组时间获取颞骨段面神经组织，