棉花遗传转化及体细胞无性系变异研究-作物遗传育种专业毕业论文.docxVIP

摘 摘 要 中文摘要 棉花是世界上第一位的天然纤维作物和第二大油料作物，棉花的生产和：自费是全球经济 的支柱之一，在我国国民经济中也占有非常重要的地位。rh于棉花的种质基础非常狭窄．且 由于K期以来通过品种间杂交进行育种，品种间的遗传变异越来越小，常规育种方法在棉花 遗传改良上已不象过去那么有效，我们需要新的手段来培育棉花新品种，以提高单产，改进 纤维品质，降低生产成本，提高棉农收益。 转基因技术是实现作物品种定向改良的新手段，它一经出现就在棉花上得到了成功的运 用。转基因抗虫棉和抗除草剂棉在生产上得到了广泛应用，带来了可观的效益。但是，棉花 仍然是一个遗传转化比较困难的作物，存在转化周期长，基因型限制和再生植株变异频率高 等不足，需要对转化技术进行改进。 病害也是棉花生产中的严重问题，虽有转基因抗虫棉和抗除草剂棉的成功。但尚未有关 于转基因抗病棉花的报告。因此，有必要将抗病基因转入棉花，评价其效果。 棉花再生植株的体细胞无性系变异的频率比较高，这对转基因工作的开夏是很不利的。 另外，植物体细胞无性系变异现象本身也是很值得研究的，因此，有必要对棉花体细胞无性 系变异的规律和机理进行分析。本文对棉花的遗传转化方法进行了比较，建立了高效遗传转 化体系，然后将多个抗病基因导入棉花，对部分转基因植株的形态特征进行了分析；对棉花 体细胞无性系变异的几个特征进行了分析．并定位研究了棉花再生植株的一个花变异体ehvl 的形态特征和基因表达。主要研究结果如下： 1．高频再生材料的筛选 在无激素但KN03加倍的MSB培养基上，冀棉14和川棉239体胚苗种子的下胚轴切段 诱导愈伤组织形成的频率为70％2皇右，这些愈伤组织90％以上都能形成体胚，最快能在3个 月内实现再生。在用冀棉14体胚苗种子的下胚轴切段进行培养时，观察到典型的直接体胚发 生现象，发生频率为25．5％。体胚苗种子田间繁衍后代保持较强的体胚发生能力，但单株间有 差异。冀棉14体胚菌种子分别在含1AA0．5mg几+KT0．1mg，L、2,4．DO．1mg／L+KT0．1mg／L和 ZT2．0mg／L的MSB培养基上培养，体胚发生频率分别为87．3％、63．90／o和90．0％．是高频再生 材料。 2．遗传转化方法研究 胚性禽伤组织基因枪转化：以川棉239胚性愈伤组织为受体，用基因枪注导入外源基因， 获得了经GUS组织染色鉴定的转基因檀株。以GUS基因瞬时表达蓝点数为评价指标，考察 了影响基因枪转化的几个因素，结果表明：使用碱裂解法提取PEG纯化的质粒DNA优于试 剂盒大量提取的。当轰击压力为1550PSl时，轰击距离设为6cm或9cm较好，轰前经I～2周 培养的愈伤组织较佳。实验还表明：玉米Ubi启动子在棉花胚性愈伤组织中有活性。 胚性愈伤组织农杆菌转化：以冀棉14胚性愈伤组织为受体材料，农杆菌介导法导A2,b源 基因，获得了经GUS染色鉴定的转基因植株。优化后的转化程序为：农杆菌用YEB液体培 养基培养36h后，离心收集菌体，用含1001．unol／L乙酰丁香酮的液体MSB培养基重悬菌体． 西南农业人学博士学位论文调OD600到0．4左矗，感染20rain，24～25℃暗培养3d．真接用含Km 西南农业人学博士学位论文 调OD600到0．4左矗，感染20rain，24～25℃暗培养3d．真接用含Km 100mg／L的MSB+ IAA0 5mg，L+KT0．1111JL的培养基筛选抗性愈伤组织，体胚诱导和成熟阶段也加入 Kinl00mg／L。再生植株的GUS染色率在90％以上。 下胚轴农轷菌转化；以有GUS基因瞬时表达的外植体百分数为评价指标，研究不同丰才料 对农杆菌的敏感性．发现子叶外植体晟敏感，下胚轴次之，胚根较差。供试的6个品种都能 被农杆菌感染，但敏感性有差异。愈伤组织诱导培养基用MSB+2．4．DO．1mg／L+KT0．Im鼬L优 于MSB+IAA0．5mg／L+KT0．Im∥L。只有当使用冀棉14体胚苗种子作外植体时．获得了转基因 植株。萌发前的培养阶段可以一直加入Kml00m∥L。抗性植株叶片GUS染色呈阳性。 3．抗病基因导八棉花 以川棉239胚性愈伤组织为受体，用基因枪法导入DSB基因，获得了4个经PCR验证的 转基因株系：以川棉239茎尖为受体。用基因枪法导入CEMA基因，获得3株转基因嵌台植 株；应用胚性愈伤组织农杆菌转化法，导入AFP．SPCEMA双价基因，共获得6个抗性细胞系， 再生抗性植株28株。Southem杂交鉴定表明，AFP基因已经整合进棉花基因组：用下胚轴农 杆菌介导法导入AFP．CHI双价基因，共获得抗性细胞系10个、再生抗性植株100余株，CHI 基圊的鳢台经PCR扩增证实：以下胚轴和胚性愈伤组织为受体，用农杆菌介导法导入 SPCEMA．CH