DNA RAN 琼脂糖凝胶电泳.pptxVIP

核酸的提取及琼脂糖凝胶电泳 核酸 组成 理化性质核酸分离、纯化的原则核酸提取的基本步骤 材料准备 细胞裂解 分离、纯化 沉淀溶解DNA提取的常用方法RNA提取的常用方法核酸的保存琼脂糖凝胶电泳目录核 酸(nucleic acid)核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作 。Genomic DNA ( 原核、真核、病毒 )细胞器DNA ( 叶绿体、线粒体等)DNA质粒DNA ( 细菌、放线菌等 )核酸mRNA ( 1%-5% )rRNA(80%-85%)tRNA(小分子RNA) (15%-20%)RNA理化性质 DNA化学性质稳定，物理上易碎，粘度大 RNA化学性质比DNA活泼，易受RNA酶的污染溶解性 均溶于水 不溶于一般有机溶剂,在70%乙醇中形成沉淀 核酸的理化性质核酸分离、纯化原则 1、保持核酸分子一级结构的完整性 温度不要太高 控制pH值范围(pH值5-9) 保持一定离子强度 减少物理因素对核酸的机械剪切力核酸分离、纯化原则2、防止核酸的生物降解核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂DNA酶抑制剂金属离子螯合剂： DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，常用EDTA(乙二胺四乙酸)离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。阴离于型表面活性剂 SDS除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物有核酸酶抑制剂作用。RNA酶（RNAase)抑制剂DEPC(二乙基焦碳酸盐) 粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。与蛋白质中His 结 合使蛋白变性。 使用注意： 1.DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。 2.容易降解，保存在4 ℃或液氮中； 3.剧毒。Rnase 污染的10大来源 1：手指头 2：枪头 3：水/缓冲液 4：实验台面 5：内源 Rnase 6：RNA 样品 7：质粒抽提 8：RNA 保存 9：阳离子 (Ca, Mg)10：后续实验所用的酶 DNA提取的基本步骤I.材料准备II.裂解III.分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸V.溶解基因组DNA的提取使用新鲜材料，样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集材料准备细胞裂解含蛋白酶的裂解方法：基因组DNA高浓度蛋白变性剂的裂解方法：RNA含CTAB的裂解法：富含多糖的样品的基因组 DNA含SDS碱裂解法：质粒DNA 裂解液经典的裂解液几乎都含有去污剂和盐，可以抑制样品中的核酸酶核酸分离、纯化蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤 核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；蛋白酶处理核酸分离、纯化 多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。核酸沉淀、溶解重新调整核酸的浓度；去除溶液中某些盐离子与杂质。有机沉淀剂乙醇 优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含乙醇易挥发除去，不影响以后实验。 缺点： 需要量大，一般要求低温操作。异丙醇 优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。一般不需低温。 缺点： 易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗。核酸的保存(1) 对DNA ① DNA样品溶于pH8.0的TE，4 ℃或-20 ℃保存； ② 长期保存样品中可加入1滴氯仿。(2) 对RNA ① RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70 ℃保存; ② 长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; DNA提取的常用方法　基因组DNA的提取 SDS法　其它基因组DNA－SDS法原理SDS在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。SDS提取缓冲液的配方 组份 Tris-HCl （pH8.0）　EDTA （pH8.0）NaCl SDS 终浓度 100mM 20 mM1.4M2%(W/V)Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中；SDS 裂解细胞，使蛋白变性，染色体离析；其他方法　根据核酸分离纯化方式的不同有：　吸附材料结合法：高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。高盐低pH值结