实验一二三四DNA重组技术.pptVIP

碱裂解法小量制备质粒DNA 一．实验目的及背景 质粒是染色体外的DNA分子，大小可为1kb到200kb。 大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。 其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。 质粒的应用 质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。 本实验目的 本实验要求掌握最常用的质粒的提取方法。 分离质粒DNA方法 从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的 碱变性法； 煮沸法； SDS法； 各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化。 碱变性法基本原理 1. 溶菌酶 2. 碱裂解： SDS, NaOH pH 12.0-12.5 3. 中和： pH 4.8 醋酸钠 碱变性法基本原理 在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。 将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的