PCR及分子标记-生命经纬.PPTVIP

PCR 及分子标记 The PCR cycle 95℃ step to denature the duplex DNA, An annealing step of around 55℃ to allow the primers to bind, 72℃ polymerization step. Mg2+,dNTPs are required in addition to template,primers,buffer and enzyme procedures template(DNA or RNA), primers, Taq enzyme, 10×PCR buffer, Mg++, 5mmol/L dNTPs pre-denaturation--denature completely Denaturation annealing Elongation cycles:25-30 Taq DNA聚合酶 分离:1969年，美国黄石国家公园温泉 分子量:94KDa 活性：在几种水生栖热菌中活性最高，200 000U/mg Taq DNA聚合酶 离子需要：对Mg2+、单价离子性质和浓度较 敏感。最适浓度为50mmol/L。 忠实性:没有校正单核苷酸错配功能--致命弱点。一般出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环，利用PCR克隆、测序时尤应注意。 Taq DNA聚合酶 抑制剂:尿素、乙醇、DMSO、DMF、甲酰胺、SDS及许多其他化学药剂。 内源DNA:不同来源的酶可能由于制备过程中残留的原细菌DNA或PCR产物的污染而含有不明来源的DNA。在使用扩增保守序列的通用引物时，会在无模板对照管出现扩增带。 保存:在-20℃至少6个月。 PCR技术的应用 遗传性疾病 地中海贫血的基因诊断 血友病 苯丙酮尿症 传染性疾病 肝炎 性病 肿瘤 法医学 个人识别、亲子鉴定 1985年，英国遗传学家Jeffreys采用DNA 指纹图谱进行个人识别和亲子鉴定。 有时犯罪物证量很少，不足以用来进行DNA指纹分析，PCR有效解决这些问题。对于犯罪现场中遗留的少量生物物证，如一根毛发、一滴血等都可用于分析，在法医学上认证罪犯、亲子鉴定以及人的性别鉴定中PCR技术被普遍采用。 植物遗传育种 构建遗传图谱、分离目的基因、 基因定位 分子标记辅助育种 了解不同品种间的亲缘关系、系统进化 畜 牧 畜禽病诊断:猪伪狂犬病毒、猪口蹄疫病毒、猪瘟病毒、牛白血病毒、牛病毒、性腹泻病毒、免疫缺陷病毒等检测 性别鉴定：牛、绵羊Y染色体上特异 DNA片段 构建基因图谱 检测基因整合与表达：转基因鱼 植物保护 杀虫病原微生物的基因型鉴定 植物病原微生物分类 形态学上相似性和潜在的血清学交互反应，用常规方法难以区分，采用反转录PCR（RT-PCR）可准确快速区分 Molecular marker 优点 数量丰富、信息量大； 与生长发育无关，取材不受限制； 较多共显性，信息量完整 在真核生物中，基因组DNA多态性要远远多于各种基因的遗传多态性，因为基因组中存在着大量的不编码的DNA序列，它们的变异不受或较少地受自然选择的制约 Applications 种质资源研究 品质纯度鉴定（包括DNA指纹鉴定） 构建遗传连锁图 基因定位（QTL） 标记辅助选择 比较基因组研究 基因克隆（图位克隆） 生物起源、进化、医学及法医学 三个步骤 (1)DNA酶切及人工接头连接，对提取DNA质量要求较高，需避免其它DNA污染和抑制物质的存在； (2) 扩增反应； (3) 通常在4％-6％的变性聚丙烯酰胺凝胶上分离 SSR（ Simple sequence Repeat ） =(microsatellite) =(Short Tandem Repeat,STR) Satellite DNA：真核生物基因组酶切、离心后，在 主带附近会出现（AT）含量很高的简单高度重复序列。 Microsatellite DNA：一类由几个核苷酸（一般1-5个，基序很短）为重复单位串联而成的DNA序列。 继RFLP之后的第二代分子标记 多态性好、重复好、共显性标记 特点 微卫星DNA广泛存在：人和动物（TG）n， 植物（AT）n 微卫星DNA长度的多态性 微卫星DNA两端多是高度保守的单拷贝序列 原理 根据两端序列的保守性，设计引物；进行 PCR，电泳分离，染色显带以检测微卫星序 列多态性。 applications 构建遗传连锁图 种质资源鉴定 标记辅助育种 基因诊断与治疗：一些人类基因病的产生与三核苷酸重复序列动态有关。 其他 简单序列重复区间（Inter-simple Sequence Repeat, ISS