羟基蛋氨酸铁(铜、锰、锌)螯合率的测定长沙兴嘉生物工程有限文档.docVIP

羟基蛋氨酸铁(铜、锰、锌)螯合率的测定 长沙兴嘉生物工程有限公司质检中心 氨基酸微量元素螯合物的生物利用率比无机离子的利用率高2~3倍，使用氨基酸微量元素螯合物是解决过量添加无机盐造成环境污染这一难题的有效方法，同时也防止了无机盐产生的不良影响及对维生素的拮抗作用。但氨基酸微量元素螯合物在饲料生产中应用还比较滞后，其原因除了价格因素外，缺乏合适的质量检测方法，也是推广应用的一个重要障碍，目前在产品标签保证值中大多仅明示矿物元素和氨基酸的百分含量，用户无法客观地评价螯合物产品质量。本研究旨在为羟基蛋氨基酸螯合物的质量检验提供一种简便实用的方法。 1 原理 试样经加热溶解、离心分离，分成沉淀态螯合元素、可溶性螯合元素及游离态金属离子。可溶性螯合元素及游离态金属离子经过凝胶色谱，在规定条件下洗脱，实现可溶性螯合态金属元素和游离态金属离子的分离，从而可分别测得螯合态金属元素和游离态金属离子的含量，分别用原子吸收光谱法测定沉淀态螯合元素、可溶性螯合元素及游离态金属离子的含量，即可计算出相应的氨基酸螯合物的螯合率。 2 试剂和材料 实验用水应符合GB6682中三级用水的规格，使用试剂除特殊规定外，均为分析纯。 2.1 克拉克—鲁布斯（Clark—lubs）缓冲溶液的配制 2.1.1 pH7.0的克拉克—鲁布斯（Clark—lubs）缓冲液的配制 分别量取1.0mL氢氧化钠(0.1mol/L)溶液,12.5mL硼酸(0.4mol/L)溶液，12.5mL氯化钾(0.4mol/L)溶液，注入100mL容量瓶，稀释至刻度。 2.1.2 pH9.0的克拉克—鲁布斯（Clark—lubs）缓冲液 分别量取20.8mL氢氧化钠(0.1mol/L)溶液,12.5mL硼酸(0.4mol/L)溶液，12.5mL氯化钾(0.4mol/L)溶液，注入100mL容量瓶，稀释至刻度。 2.1.3 pH10.0的克拉克—鲁布斯（Clark—lubs）缓冲液 分别量取43.7mL氢氧化钠(0.1mol/L)溶液,12.5mL硼酸(0.4mol/L)溶液，12.5mL氯化钾(0.4mol/L)溶液，注入100mL容量瓶，稀释至刻度。 2.2 乙二胺四乙酸二钠溶液[C(EDTA)=0.1mol/L]。 称取37.2g乙二胺四乙酸二钠加热溶于100mL水中。 2.3 葡聚糖凝胶（G-15） 2.4 盐酸（1+10） 3 仪器 3.1 恒温水浴锅 30~80℃可调 3.2 原子吸收分光光度计 波长范围190~900nm 3.3 离心机 转速能达到3000r/min。 3.4 色谱柱300×9mm 4 测定步骤 4.1 试样预处理 称取试样约0.5g，精确到0.0002g，置于25mL离心管中，加入15mL水，于60℃水浴中，加热30min，不时搅拌，使试样充分溶解，于2500r/min离心10min。将上清液小心移入25mL容量瓶中，沉淀用4mL×3热水（60℃）洗涤，离心，上清液一并移入25mL容量瓶中，定容，得可溶性螯合态金属元素溶液，称为A液。沉淀用10mL盐酸溶液（2.4）溶解，转入25mL容量瓶中，用水稀释至刻度，得沉淀态螯合态金属元素溶液，称为B液。 4.2 凝胶色谱柱的制备 称取约10gG-15凝胶，配制成适当粘稠的悬浮液，静置3h，沿玻璃棒将排尽气泡的凝胶悬浮液一次倾入色谱柱内，待凝胶全部倾入柱内后，开启柱下面的出口开关，流出液体，使凝胶自然沉降。控制凝胶部分长度在15~20cm。 开启柱下部出口开关，用约50mLpH7.0的洗脱液洗涤凝胶色谱柱。 4.3 上样 排出洗脱液至凝胶表面近于流干，关闭出口开关；用移液管移取0.2mL溶液A，吸管口离床表面约1mm，小心加入样品液，使之均匀渗入床表面；打开出口开关，使样品流入凝胶床，用少量洗脱液小心洗涤柱壁周围及残留在床表面的样品；注入洗脱液，测定Cu、Fe、Zn的螯合物时，用pH9.0硼酸洗脱液；测定Mn的螯合物时，用pH10.0硼酸洗脱液。 4.4 洗脱分离 用相应pH的洗脱液洗脱，流速为0.7mL/min，收集洗出组分约100mL，定容至100mL，得可溶性螯合金属元素溶液，称为C液。可溶性螯合金属元素分离完成后，在凝胶柱顶端用吸管移入1mL EDTA(2.2)溶液，用pH7.0硼酸洗脱液继续洗脱，合并所有洗出组分，定容至100mL，得游离态金属离子溶液，称为D液。 5 测定 将上述A液、B液、C液、D液稀释至一定浓度（稀释倍数视含量而定），按GB/T13885上机测定，分别测定溶液中金属元素的含量。 6 螯合率的计算 氨基酸螯合物螯合率按式(1)计算： X= ABS()