实验一 质粒DNA的提取及检测.ppt

* 图1的电泳结果不是很好，一方面上样量太大不同构象的质粒分子没有分开；另一方面有些样品RNA去除得不好，在电泳结果上可以看到大团的荧光；此外还要注意上样的技巧，上样后稍沉降一会，使样品均匀地分布于上样孔的底部再开始电泳，这样走出的条带会较均匀。图2的结果较好。 六．注意事项 为提高质粒产量，要注意下面两个步骤： 加入溶液I 后，涡旋振荡应充分打散菌体使之均匀悬浮； 加溶液II裂解要完全(快速轻柔颠倒5~10次) ，使蛋白质和核酸变性； 加溶液III后pH要达到中性(轻柔振荡5~10次 )，使质粒DNA复性，这样才能使质粒DNA与染色体DNA完全分开，否则，难分开，所以裂解和复性这两步要从严掌握。 * 动画效果 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 实验一 质粒DNA的提取及检测 　　　质　粒（plasmid） 是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。 常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等 质粒的复制：严紧型复制（1~n个） 　　　　　　　松弛型复制（20个以上） 常用的质粒载体 是通过DNA重组技术构建而成的。pUC18, pUC19 质粒提取的思路 质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA 要去除的物质： 　蛋白 　基因组DNA 　脂类及小分子杂质 　RNA 第一部分　质粒DNA的提取 一．目的 了解提取质粒的原理。 学习和掌握质粒提取的方法和技术。 细菌的生长和质粒的扩增 菌体的收集裂解及质粒DNA的分离 质粒DNA的纯化 二．原理 碱变性法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异： 在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态； 将pH调至中性并有高浓度盐存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA（可省略）。 ☆原理示意图 返回目录 返回原理 三、实验仪器、材料与试剂 （一）仪器：恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅 （二）材料：含pUC18（或其他）质粒的大肠杆菌、 （三）试剂： LB培养基（液体、固体） 溶液I 　 溶液II 　 溶液III 　 TE(pH8.0) 溶液 I 50 mmol/L 葡萄糖/1mg/mL溶菌酶 25 mmol/L Tris·Cl (pH8.0) 10 mmol/L EDTA (pH8.0) 在10 lbf/in2(6.895×104Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟，保存于4℃。 作用：裂解细胞，鳌合金属离子使金属酶失活 溶液 II 0.2 mol/ L NaOH(从5mol/L贮存液中现用稀释) 1% SDS 作用：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。 溶液 III 5mol/L 乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml 所配成的溶液中钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。 作用：酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白-SDS＋线性DNA沉淀，K＋可中和DNA TE(pH8.0) 10 mmol/L Tris·Cl (pH8.0)1 mmol/L EDTA (pH8.0) RNA酶（降解RNA） 作用：稳定ＤＮＡ 特点：小量质粒制备、最简便、快捷 应用：质粒酶切鉴定、克隆（粗提） 测序、转染（细提） 质粒提取试剂盒 常用方法：小量碱裂解法 满足不同需要的试剂盒 纯化原理：离子交换柱层析等 小量制备质粒kit 大量制备质粒kit 去除内毒素制备质粒kit 可用于大部分分生实验 　　　　四、实验步骤 接含pUC18(或pET21a)质粒的单菌落于3ml LB Amp+液体培养基中 ? 370C，190rpm振荡培养过夜 ? 取1.5 ml菌液入1.5ml的离心管中 6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体 ? 100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温10min ? 加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体 ? 加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置15min质粒DNA复性 ? 12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管 ? 上清加等体积的酚：氯仿（振荡混匀） ? 12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管 ?