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淋巴细胞转化实验报告 　　西南大学《细胞生物学自主实验》　　课程论文　　论文题目：人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析　　学院：生命科学学学院　　专业：生物科学　　班级：XX级3班　　姓名：张萌　　学号：　　22XX　　人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析　　【摘要】本文主要介绍通过对人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析，初步了解到对人体外周淋巴细胞培养方法与人类体细胞染色体核型分析的方法。采用人工离体培养的方法，采集人体外周血淋巴细胞，在加有植物血球凝集素的培养基中培养，经过恒温培养，秋水仙素处理、低渗和固定，获得大量有丝分裂中期细胞，最后经空气干燥法制片，对人体外周淋巴细胞进行染色体核型分析。　　【关键词】人体外周血淋巴细胞染色体核型分析细胞培养1综述　　细胞培养是在体外模拟体内的生理环境培养从机体中取出的细胞并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。要使细胞能在体外长期生长必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度、注意外环境酸碱度和渗透压的调节；二是严格控制无菌条件。　　染色体是组成细胞核的基本物质,是基因的载体。人类细胞遗传学研究的主要对象是染色体。本实验采用了微量全血培养技术，既方便又节省人力物力。在正常情况下,人外周血中是没有分裂相的,只有在异常情况下才能发现。植物血细胞凝集素(PHA)是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂,在PHA作用下,原处于G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞,进而进行有丝分裂。利用PHA这一特性,淋巴细胞经过含有　　PHA培养液培养,在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体,终止分裂中期的淋巴细胞,经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定就可获得大量的中期有丝分裂细胞。最后经空气干燥法制片，便可得到质量较好的染色体标本，即可得到所需的人体染色体图形。　　染色体组型又称核型,是指将动物、植物、真菌等的某一个体或某一分类群亚种、种、属等的体细胞内的整套染色体按它们相对恒定的特征排列起来的图像。核型模式图是指将一个染色体组的全部染色体逐个按其特征绘制下来，再按长短、形态等特征排列起来的图像。染色体组型分析就是通过对染色体标本和其照片进行测量、　　对比分析、代分类学、生物进化和遗传育种学等研究中是重要的研究手段。对于任何一个染色体的基本形态特征来说重要的参数有以下3个:　　(1)相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X或Y染色体)的总长度×100%　　(2)臂指数=长臂/短臂　　(3)着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×　　100%　　数。　　：中部着丝粒染色体；　　：亚中部着丝粒染色体；　　：亚端部着丝粒；　　：端部着丝粒染色体　　人类体细胞的正常核型是含有23对染色体，共46条。其中22对是男女共有的染色体，一对为男女所不同的性染色体，男XY,女XX。2实验仪器试剂及材料　　材料:人的静脉外周血。组内选取男女各一名取血样。　　试剂：RPMIl640培养基、浓度为10mg/ml的PHA、/ml秋水仙素溶液、Giemsa染液、低渗溶液、NaHCO3、Carnoy固定液等。　　器材：恒温培养箱、恒温水浴箱、离心机、分析天平、显微镜、超净工作台、移液管、离心管、培养瓶、试管架及试管、镊子、量桶、烧杯、酒精灯、染缸、染色架、胶头滴管等。　　3　　实验方法与步骤　　RPMI-1640　　基础培养基的配制　　RPMI-1640粉末先用约800ml三蒸水溶解，再加入其他成分混匀，定容到1000ml，用5%NaHCO3调pH至，然后用过滤方式灭菌，最后分装至离心管中。　　实验所用药品及器皿的无菌处理　　(1)实验用的所有器皿,器具都必须按规定洗净,高压灭菌处理备用。器具清洗方法：　　清洗→烘干→浸酸→流水冲洗→蒸馏水冲洗。　　细胞培养　　向培养瓶中加入血液，再加入培养液5ml以及PHA47微升。置于37℃培养箱中培养66到72小时，其间每隔24小时摇一次　　淋巴增殖实验:　　第一种，取外周血和脾脏分离淋巴细胞用于淋巴增殖实验,具体步骤如下　　⑴雏鸡翅下釆血2mL,加入1mL抗凝血和1mLPBS的混合液,混合均匀后,缓缓加入装有2mL淋巴细胞分离液的无菌透明的大离心管中,不要摇晃,注意血液与淋巴细胞分离液不要混合,XXrpm,离心20min,可以看见中间有层白色雾状白细胞,吸取白细胞至2inL离心管中,XXrpm离心5min取沉淀;　　(2)向离心管中加入1mL1640清洗2遍,XXrpm离心5min取沉淀;⑶将沉淀悬于1mLDMEM,细胞计数板计数,取1xlO7个细胞悬于ImLPBS中,置于37°C培养箱中用CFSE(终浓度2g