ELISA检测抗体.ppt

成绩 课堂表现及出勤情况，占5分 实验报告，占10分 期末考试，占10分 注意事项 封闭时注意将封闭液加满各反应孔，并去除各孔中可能产生的贴孔壁气泡。 加洗涤液时，每孔加满，但不要溢出。 加不同样品时更换枪头 每次洗涤液在孔中的停留时间不应少于1 分钟。可水平震荡，增强洗涤效果。 洗涤后板要甩干，不要残留液体。 加终止液后10分钟内测量OD值。 结果分析 阳性对照与阴性对照：阳性对照显色应明显深于阴性对照，否则该实验失败。阴性对照应接近无色，否则反应本底过高，影响反应灵敏度。待测样品：以阴性对照为参考，根据待测孔颜色深浅，将待测样品中特异性抗体浓度标为“-”（无色），“+”（浅色），“+ +”（黄色），“+ + +”（棕黄色）。 本次ELISA采用的是间接法检测抗体，定性检测。 免疫胶体金技术 免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。 胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。 常用免疫胶体金技术 （1）免疫胶体金光镜染色法 （2）免疫胶体金电镜染色法 （3）胶体金免疫层析法 胶体金免疫层析法 将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂（抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。如检测早早孕 实验报告 实验原理 实验目的 实验相关试剂和器材 实验流程 实验结果 讨论分析 试剂与器材 待测血清、阳性对照、阴性对照血清。 样品稀释液（PBS） 包被液：绵羊红细胞抗原+PH9.6碳酸盐缓冲液 封闭液:5% BSA/PBS 溶液 洗涤液:PBST，(含Tween-20的PBS液) 辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗鼠抗体，即酶标二抗 一端与辣根过氧化物酶结合，另一端与血清中抗SRBC抗体的C区结合 底物缓冲液A液（0.1mol/L枸橼酸溶液）B液（0.2mol/L Na2HPO4）： 底物是现用现配，A 和B液混合后，15min内使用。 邻苯二胺 H2O2 终止液：2mol/L 硫酸。 聚乙烯ELISA板，微量加样器，枪头，滤纸，37度温箱，EP管。 实验流程 SRBC冻融稀释→包被液每孔100ul→37度1h→弃液，洗板三次→加封闭液每孔200ul→37C温箱孵育30 min→弃液，洗板3次→阳性对照，阴性对照,待测一（本组），待测二（邻组）每孔100ul→37C温箱孵育1h(不少于1h)→弃液，洗板3次→加入酶标二抗每孔100ul→37C温箱孵育 1h(不少于1h) →弃液，洗板不少于7次→加入底物各100ul→室温避光反应10 min→每孔加入终止液50ul→目测观察或酶标仪检测。 实验课总结 我们在四次免疫学实验课中系统的学习了体液免疫和细胞免疫的经典和常用的一些免疫学实验技术。第一次实验课的抗原免疫小鼠，小鼠产生体液免疫应答，一周后血清中出现抗绵羊红细胞抗体。同时也出现细胞免疫应答，免疫细胞也得到活化。第二次实验课取血，得到免疫血清。并进行了脾细胞的计数。第三次实验课又用流式细胞术分析了小鼠体内T细胞免疫功能的变化，并通过检测NO水平来观察巨噬细胞功能的活化。用双扩实验、凝集实验和补体结合实验验证了一些理论并观察了实验现象。第四次课用ELISA法检测了小鼠血清抗体的水平。并用免疫胶体金法做早早孕检测。在一个大的综合性实验中我们了解了体液免疫和细胞免疫功能的几个基本检测方法，并观察和验证了一些理论课的知识。 ELISA的实验报告不需要写胶体金的内容，包括第一次，第二次，第四次实验课有关ELISA检测小鼠抗绵羊红细胞抗体水平实验的内容。 * * * * * Variations in the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique allow determination of antibody or antigen. Each assay can be used qualitatively or quantitatively by compari