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Western Blotting 实验操作指南 2015年3月修订版 提高实验效率! 目录 Western Blotting检测的操作方法及注意事项 1. 电泳（SDS） 2. 转膜 3. 封闭 4. 一抗反应 5. 二抗反应 6. 检测（化学发光法） Troubleshooting Western Blotting关联试剂 HRP底物 发光 （Luminol） HRP标记二抗 本手册旨在表明利用Western Blotting技术检测蛋白质时的操作要点。 Western Blotting技术是将蛋白质样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移到固相载体（例如纤维素薄膜）上，利用抗原抗 体反应来检测目的蛋白的方法。如果整个实验过程中每一个实验步骤都能成功，就可以获得很好的实验结果。 本手册按照Western Blotting实验操作流程，对各步骤的操作方法和注意事项进行了通俗易懂的说明和介绍。 另外，本手册中的Troubleshooting（故障排除）可为您解决实验操作中遇到的各种问题。 【操作流程 】 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ 泳 电 膜 转 封 闭 应 反 抗 一 应 反 抗 二 检 测 Western Blotting检测的操作方法和注意事项 ① 电泳前的注意事项 ① 电泳 凝胶的选择 (SDS) 如果已知目的蛋白的分子量，选择的分离胶浓度应使蛋白质的迁移位置在中央。如 果是未知分子量的蛋白质样品，使用梯度凝胶。 1.5 hr 样品制备 通常将检测样品还原处理后再进行凝胶电泳，但经DTT及巯基乙醇等处理的蛋白质 凝胶电泳分为SDS-聚丙烯酰胺凝胶 立体结构会发生变化，有可能抗体不能很好的识别特定的位点，就不能结合上去。 电泳（SDS）、等电聚焦电 应同时对非还原处理的样品进行凝胶电泳。 泳、二维电泳。Western Blotting通 分子量Marker的选择 常使用SDS。 为了确认转膜是否正确，应选择有色分子量Marker。但使用有色Marker时，蛋白质 会与色素结合，不适用于准确分子量的测定。估算分子量时请选择适合的荧光 Marker。 设立对照样品 为了验证凝胶电泳及转膜正常进行，检测样品应同时与阴性对照和阳性对照同时进 行凝胶电泳和转膜。 设立比对样品 因转膜效率及检测体系不同，在不同膜上截留的蛋白会存在差异，应将比对样品和