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应用综述 蛋白质分子量的测定：SEC-MALS 与传统校正 法 分子量 简介 溶液中蛋白质的物理性质和行为取决于与蛋白质的纯化和构成及其自身固有属性相关的 分子尺寸 多种因素。  尺寸排阻色谱 (SEC) 是一种强大的工具，常用于分析蛋白质的回收率、分 子量和聚集性。 SEC 的工作原理涉及在样品流经多孔的惰性色谱柱基质时对样品进行分离。  较小的分 子进入填料孔内，而较大的分子则被排除在外，因此可更快速地通过色谱柱。  结果是获 得基于流体力学体积的分离，但是人们通常要求得出分子量。  以前，通过比较未知蛋白 质与（已知分子量的）标准球状蛋白质的洗脱时间估算分子量，我们把这一过程称为“传 统校正法”。  通常使用诸如紫外 (UV) 等单一的浓度检测器完成上述操作。  然而，现在 我们联合使用光散射检测器和浓度检测器（紫外或折光率，RI），可不依赖保留时间测 定蛋白质分子量。  这一进步非常有用，因为许多蛋白质不具有球状结构，使得它们测得 的分子量不准确。  由于增加了更多检测器（如另一台浓度检测器）、特性粘度 (IV) 和 动态光散射 (DLS) 检测，可极大地增加单次 SEC 测定所获得的信息量。 Malvern SEC-MALS 20（图 1）系统是一款 20 角度光散射设备，能够不依赖于洗脱体 积测定蛋白质分子量。  在此应用说明中，一些蛋白质使用 SEC 进行分离。  使用多角 光散射 (MALS) 或传统校正法测定它们的分子量，  并讨论了这些结果的差异。 Malvern Instruments Worldwide Sales and service centres in over 65 countries /contact ©2015 Malvern Instruments Limited 应用综述 图 1：Viscotek SEC-MALS 20 系统 材料和方法 将 SEC-MALS 20 系统连接至使用 TDA RI 检测器的 Viscotek TDAmax 系统以测定浓 度。  样品沿 2 根 Viscotek 蛋白柱以磷酸盐缓冲液作为流动相进行分离。  所有蛋白质样 品均溶解在流动相中。  使用牛血清白蛋白（一种分子量表征良好的蛋白质）校准 SEC- MALS 20 系统。  使用一系列球状蛋白质（用于分子量为 29,000-700,000 Da 的蛋白质 的凝胶过滤标记物试剂盒，Sigma-Aldrich）进行色谱柱校正。 该检测器和色谱柱均置于 30°C 环境下，以确保良好的分离效果和最佳的检测器基线稳 定性。 结果 作为系统验证，应经常检查校准品，而 BSA 二聚体（通常存在于 BSA 样品中）是一种 极好的检验标准品。  这种情况下，已正确测定二聚体的分子量，并对样品中存在的三聚 体进行了精确测定。  BSA 色谱图见图 2，而 BSA 测定的结果见表 1。  图 2