慢性髓系白血病相关PTP家族成员的表达谱芯片筛选和初步功能分析-内科血液病学专业毕业论文.docxVIP

英文缩略词表 英文缩略词表 NaAC neo Sodium acetate neomycìn phosphotransferase gene 醋酸销 新酶素磷酸转移酶基因 00 Optical Density 光密度 PBS Phosphate Buffered SaJine 磷酸缓冲盐溶液 PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应 PE Phycoery由rin 藻红蛋白 PI Propidium Iodide 模化丙旋 RT-PCR Reverse-Transcription PCR 反转录 PCR RNA ribonucleic acid 核糖核酸 叩m revolutions per minute 每分钟转数 S DNA-s泸lthetic phase DNA 合成期 SDS Sodium Dodecyl Sulphate 十二烧基硫酸销 SPSS Statistical Package for Social Science 社会科学统计软件包 -2- -匿性髓系白血病相关PTP家族成员的表达谱芯片筛选和初步功能研究 -匿性髓系白血病相关PTP家族成员 的表达谱芯片筛选和初步功能研究 中文摘要 研究背景与目的： 第9号与第22号染色体相互易位形成的Pb染色体是慢性髓系白血病 (cllromc myeloid leukemia，CML)的肿瘤恶性克隆标志。这种染色体平衡 易位导致9q34上的c．Abl原癌基因与22q11上的Bcr(breakpoint cluster region)基因断裂后并置，形成新的融合基因Ber-Abl，后者转录翻译的 P210Bc“AB。蛋白具有异常增高的蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kil【1ase， PTK)活性，被认为是导致CML发病的根本原因。P210Bc舡AB。导致CML 发生的分子病理机制涉及多个信号通路，但最原始的信号启动因素则是过 高的PTK活性催化P210Bc8”。自身和底物蛋白上特定位点的酪氨酸残基 (tyrosine residue，Tyr)过度磷酸化所致。 在机体内，蛋白Tyr的磷酸化程度是直接调控诸多信号传导途径中信 号的触发与终止、放大与衰减的重要因素。Tyr磷酸化水平的异常常会打破 生理状态下多个信号网络的平衡，导致许多疾病如肿瘤的发生。近年来研 究发现Tyr的磷酸化是一个可逆的动态过程，主要受PTK和蛋白酪氨酸磷 酸酶(protein tyrosine phosphatase，PTP)两大酶家族控制，它们互相拮抗与 协调，在机体内构建了一个调节Tyr磷酸化状态的网络。我们设想，当PTK 活性异常增高的P210Bc艮AB。打破了细胞内部PTK—PTP网络的平衡，使细胞 发生肿瘤转化的过程中，机体为了维持自身的内部稳定必会作出相应的调 节，而基因在mR_NA表达水平上的调整又常是机体调节基因功能的最基本、 最有效的方式之一。因此我们试图(1)应用P210BCR-AB。特异高效的PTK 抑制剂STl571封闭P210BcR。AB。的活性并诱导其凋亡；在此基础上应用表 达谱基因芯片对STl571处理前后K562细胞(人CML急变细胞株)部分 PTP的表达差异进行分析，并用半定量RT-PCR对芯片结果进行验证，确定 下一步研究的候选PTP基因。(2)对候选基因在慢性原代细胞中的表达进 行半定量RT—PCR分析，初步确定候选基因的临床相关性；在此基础上应 用RT．PCR克隆该基因全长eDNA，并构建真核表达载体。(3)应用脂质体 用RT．PCR克隆该基因全长eDNA，并构建真核表达载体。(3)应用脂质体 转基因技术进一步探讨候选基因的潜在功能如诱导凋亡与分化等。 研究方法： 观察STl571(1．0umol／L)不同时间点诱导K562细胞凋亡的规律及相 应各组细胞胞浆总PTP活性的改变。选择最适合的STl571作用时间处理 K562细胞，应用BioStarH40s型表达谱芯片对处理前后的21个PTP成员 表达差异进行检测。对表达差异显著的PTP基因进行生物信息学分析，确 定下一步研究的目标。根据基因序列号设计引物，应用RT-PCR法克隆候 选PTP的全长eDNA序列并定向亚克隆于真核表达载体pcDNA3．0。在进 一步测序和酶切鉴定所克隆的基因序列正确后，应用脂质体转染技术使候 选基因在K562细胞中过表达。通过凋亡检测(Hoeehst33258染色后荧光显 微镜观察形态，AnnexinV-PI双标后FACS分析)、分化检测(联苯胺染色， GPA表达率分析)和细胞周期分析，初步探讨候选PTP成员的潜在功能。 实验结果： 1．STl571(1．0IlInol／I。1作用K562细胞12、24和48小时；AnnexinV-