抗流感病毒单克隆抗体的制备与鉴定-生化与分子生物学专业毕业论文.docxVIP

华中农业大学学位论文独创性卢明及使用授权书学位论文 华中农业大学学位论文独创性卢明及使用授权书 学位论文 是否保密 毛 如需保密，解密时间 年 月 日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果．尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材科，指导教师对此进行了审定．与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意． 研究生签名： ；端嚆 时问： 2-o,f年6 月j岁日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存，使用学位论文的规定”，印学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印，缩印或扫描等复制手段保存，汇 编学位论文．本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表，传播学位论 文的全部或部分内容． 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书． 学位论文作者签名：斟书谚导师签名薹锄’ 签名日期：2∞z年6月侈日 签名日期：厶《年／月／j日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之问 抗流感稿毒单克降抗体的制备～筘定摘 抗流感稿毒单克降抗体的制备～筘定 摘 要 禽流感(AI)足由A型流感病毒引起的一种禽类的烈性传染病。自1878年意大 利首先发现至今，世界各地都有特定毒株引起的禽流感爆发和流行。尤其是高致病 力禽流感可导致高达100％发病率和／或死亡率。并可直接感染人并致人死亡。而低致 病力禽流感病毒同样可以给养禽业带来灭顶之灾，对人类的威胁同样严重，目fill， 高致病性禽流感(HPAI)已被国际兽疫局规定为A类动物传染病。其防制已直接关 系到养禽业的持续稳定发展和人民的身体健康。 猪流感病毒(sⅣ)最突出的流行病学特点足同时具有感染人、禽的潜力，而且 猪可最大限度地被AIV和人流感病毒感染。因此，对SI的监测作为预测和防止流感 大暴发的最重要手段早已在欧美国家引起关注并达成共识。 A型流感病毒亚型众多，易变。目前，已经发现了16种H亚型和10种N亚型，从 而导致该病的诊断和治疗非常困难。国内对流感病毒的I临床诊断主要是对抗体的检 测。我国许多养鸡场使用禽流感灭活苗，如何区分免疫鸡群与感染鸡群却成为当日口 面临的一大难题因此，迫切需要一种较为理想的禽流感诊断方法。流感病毒的HA和 NA蛋白容易变异，但NP蛋白却相对保守．因此，利用NP蛋白和HA蛋白分别有望建 立一种所有亚型禽流感病毒的检测方法和诊断流感病毒亚型的方法。本研究利用杂 交瘤技术获得了抗禽流感病毒NP蛋白和H3 HA的单抗，为对流感病毒的进一步研究 和建立针对流感病毒的检测方法奠定基础。上要研究内容包括： 分别用甲醛灭活的和Triton x．100裂解的禽流感H9N2病毒，禽流感病毒NP基因 的原核表达产物免疫Balb／e／J,鼠，取免疫脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合。经间接 ELISA筛选，3次有限稀释法克隆。共得到6株能稳定分泌抗禽流感病毒NP蛋白抗体 的杂交瘤细胞株，分别命名为4F4、IC3、IGlI、IC2、IDl0、2E7。经3次亚克隆后， 100％的杂交瘤细胞保持了分泌抗禽流感病毒NP蛋白抗体的能力。染色体计数结果表 明所有杂交瘤细胞确实为脾细胞与SP2／0细胞的杂交产物。间接免疫荧光说明单抗的 结合活性很好。其中IGll，IDl0单克隆抗体小鼠腹水的效价最高，ELISA效价分别 为213x100和214x100。单克隆抗体1Gll、1D10分别为IgGl、IgG2a亚类。 研究结果表明，IGll、1D10单克隆抗体与禽流感病毒的NP蛋白能发生特异性 反应，而不与新城疫病毒(NDv)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒 (ILTV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、产蛋下降综合征病毒(EDS．76)，禽腺病毒1型 (APMV-I)发生反应。单克隆抗体的获得为禽流感病毒的研究及快速诊断方法的建 立奠定了基础。 用H3N8病毒免疫Balb／etJ,鼠，取免疫脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合。经血凝抑 制(HI)筛选，3次有限稀释法克隆．共得到3株能稳定分泌抗禽流感病毒HA蛋白 抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为287、1Cll、4G7．经3次亚克隆后。100％的杂交 抗流感病毒荦屯降抗体的制备’筘定瘤细胞保持了分泌抗H3N8 抗流感病毒荦屯降抗体的制备’筘定 瘤细胞保持了分泌抗H3N8 HA蛋白抗体的能力。染色体计数结果表明所有杂交瘤细 胞确实为脾细胞与SP2／0细胞的杂交产物。『ⅡJ接免疫荧光说明单抗的结合活性很好。， 单克隆抗体287、