抗线虫基因表达载体质粒构建和遗传转化研究-作物栽培与耕作学专业毕业论文.docxVIP

摘 摘 要 本研究围绕抗线虫基因的遗传转化展开，主要内容包括：1．植物表达载体的 构建：2．农杆菌介导的遗传转化试验；3．基因枪法遗传转化研究；4．抗性植株的 分子鉴定． 1提取克隆载体P1832，用^，coI酶切，经klenow补平，再经Sacl酶切， 切下完整的基因片段，然后用低熔点胶电泳，回收小片段；提取表达载体 pBll21，用SmaI和SacI双酶切，用低熔点胶电泳，回收大片段；pBll21大 片段和Pl 832小片段按1：3的浓度比混合，用T。DNA ligase连接，11℃保 温16-18小时后，反应液直接转化E coli感受态细胞，在合K+100mg／L的LB 固体培养基上涂板，在设立对照的情况下，对长出的抗性单菌落提取质粒进 行酶切鉴定，对正确的重组子取名为pBll812／DH5口并进行扩增，提取质粒 转化农杆菌Agrobacterium LBA4404，对抗性单菌落进行直接PCR鉴定，获得 pBll812／LBA4404农杆菌株，舍35s启动子，用于对双子叶植物材料的遗传 转化试验． 同样的方法，提取克隆栽体P1832，用NcoI酶切，经Klenow酶补平， 再经SacI酶切，切下完整的基因片段，然后用低熔点胶电泳，回收小片段； 提取表达载体pBIL．2，用^≯月I酶切，经T4 DNApolymerase补平，再经SacI 酶切，低熔点胶电泳回收大片段；pBIL．2大片段和P1832小片段按1：3的 浓度比混合，用T4 DNA ligase连接，同样直接转化E．coli感受态细胞并涂 板，提质粒鉴定、扩增、转化农杆菌，经鉴定获得pBll8．2／LBA4404农杆菌 株，含Ubi启动子，用于单子叶植物的遗传转化试验． 取甘蔗高产、高糖商业品种ROCl6、福衣93．3608的梢部，在超净工作 台上取心叶，横切为厚2mm左右的圆片，接种于MS+3mg／L 2,4．D的固体培 养基上，25℃，暗室内诱导愈伤组织；取生长良好的胚性愈伤组织，在MS+BA 2mg／L+NAAO．1mg／L+CaCl2 4．49／c的培养基上预培养2天，用舍】00“mol／L Acetosyringone(AJdrich)固体培养基上共培养3天，然后诱导筛选抗性愈伤组 织，最后分化成苗．再取甘蔗胚性愈伤组织，选择2ram3大小的颗粒20．30 粒，用基因枪PDS．1000／He轰击，选择抗性愈伤组织分化成苗；取大豆无茵 苗，取子叶节，用衣杆菌pBll 苗，取子叶节，用衣杆菌pBll 812／LBA4404侵染；对大豆愈伤组织用基因枪 轰击，然后在培养基1／2 MS+BA 0．5mg／L+IBA O．05mg／L+Cef250mg／L+ K+75mg／L上筛选诱导芽丛． 用微量提取DNA的方法提取抗性苗DNA，经PCR检测，获得了PCR 阳性甘蔗黄化苗3株；大豆早熟1号子叶节经农杆菌侵染后获得抗性再生苗。、j 关键词：抗线虫基因。表达载体质∥构建遗传转耙／甘蔗 大豆 引 引 言 1、关于线虫和抗线虫生物技术 线虫fNematode)是一类危害十分广泛的害虫，可分为四个群：动物寄 生线虫、海洋线虫、自由生活线虫和植物寄生线虫．植物寄生线虫的寄主 包括茄科、豆科、菊科和禾本科等达上千种植物．按照寄生方式的不同， 植物寄生线虫又有外寄生线虫(生活于根的外部)和内寄生线虫(寄生于 植物体内)之分。对农作物危害严重的大部分寄生线虫为胞囊属 (Heterodera)及球胞囊属(Globodera)的胞囊线虫和根结属(Meloidogyne) 的根结线虫，分类上归属线形动物门、线虫纲、异皮科．线虫的生活史包 括卵、幼虫和成虫三个阶段．雄成虫线状，大小为1200．1900×30．60微米， 雌成虫洋梨形，大小为400．1300 x 370．750微米．雌虫将卵排出卵囊中， 每个卵囊约有300．500粒卵，卵长椭圆形，大小为90 x 40微米．幼虫自 卵内孵化出来呈线状，即可钻入根部或于根外开始取食、生长、发育，脱 皮3次后，雌虫渐成腊肠状，4龄后又逐渐变成洋梨形，而雄虫始终为线 状。线虫口内有一吻针，用以刺穿根表皮和取食．它们的幼虫侵入寄主的 根部，诱导中柱细胞内形成高度特化的取食结构，用于满足线虫的营养要 求．根结线虫从分化的中柱形成层细胞膨大形成的多核巨细胞中取食；而 胞裘线虫从合胞体内取食，该细胞是许多邻近的细胞融合而成．线虫能抑 制取食细胞上的调节基因，进而激活寄主基因以利于形成取食结构． 植物寄生线虫生活在土壤中，主要危害植物的根部．外寄生线虫不断 取食新生幼嫩根尖，造成侧根稀少，根群几乎没有侧根，支根粗短，主根 畸形，植物失去吸收水份和养分的根尖，使得地上部分萎蔫失绿，生长缓 慢，叶边和叶尖出现黄色枯斑，叶片窄小枯焦．线虫取食造成